Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
A biologia construtivo e a abordagem de biologia sintética para criar vida artificial envolvem a montagem de baixo para cima de materiais biológicos ou não biológicos. Tais abordagens têm recebido uma atenção considerável na investigação sobre a fronteira entre a vida e a matéria não-vivo e têm sido utilizados para construir células artificiais ao longo das últimas duas décadas. Em particular, gigante vesículas (GVs) têm sido frequentemente utilizados como membranas celulares artificiais. Neste trabalho, nós descrevemos a preparação da GVS encapsulando microesferas altamente embalado como um modelo de células contendo biomoléculas altamente condensada. Os GVs foram preparados por meio de um método de centrifugação da emulsão água-em-óleo simples. Especificamente, um homogeneizador foi usado para emulsionar uma solução aquosa contendo os materiais a ser encapsulado e um óleo contendo fosfolípidos dissolvidos, e a emulsão resultante foi cuidadosamente em camadas sobre a superfície de uma outra solução aquosa. O sistema em camadas foi então centrifugado tO gerar os GVs. Este método poderoso foi usado para encapsular materiais que variam de pequenas moléculas com as microesferas.
A abordagem construtiva, ou sintética, a biologia é uma avenida fascinante para explorar a fronteira entre vida e matéria inanimada. Porque a célula é a unidade mínima necessária para a vida como nós atualmente compreendê-lo, vários investigadores têm tentado construir células artificiais de produtos químicos simples e bem compreendidas para que fenômenos que ocorrem dentro dessas células artificiais podem ser estudadas, com o objetivo final de elucidar as origens da vida e estudar as funções fundamentais das células vivas 1, 2, 3. Em particular, as vesículas 4, que são microcompartments esféricas feitas de moléculas anfifílicas e podem encapsular moléculas biológicas tais como proteínas 5, 6 e DNA 7, 8, 9,lass = "refex"> 10, têm sido muitas vezes utilizados como modelos de membranas biológicas.
As vesículas podem ser classificados como pequenas (definido como tendo um diâmetro de <100 nm), de grandes dimensões (diâmetro <1 | iM), ou gigante (diâmetro> 1 uM). vesículas gigantes (GVS) têm sido estudados extensivamente, porque eles são semelhantes a células vivas em tamanho, forma e estrutura. Devido ao tamanho da GVS, as alterações morfológicas nas membranas GV pode facilmente ser observada em tempo real, sob um microscópio óptico.
Vários métodos para a preparação de GVs foram relatados 11, incluindo o método de hidratação 12, 13, o método de congelação-descongelação 14, o método da eletroformação 15, 16, e o método de dispositivo de fluidos 17, 18. Entretanto, encapsulantes proteínas e outras MACROMolecules na GVS em concentrações elevadas por meio destes métodos é difícil. Em particular, é extremamente difícil para encapsular materiais biológicos em quantidade suficiente (20-30% em volume) para imitar o ambiente cheia no interior das células 19, 20. Para formar GVs instantaneamente, Weitz e colegas de trabalho estabeleceu uma água-em-óleo método de emulsão centrifugação 21, 22 (/ o w). Este método tem cinco características importantes. Em primeiro lugar, porque GVs preparados por este método tem baixo lamelaridade 23, 24, as suas membranas são muito finas que podem ser facilmente deformado. GV deformação da membrana induzida por FtsZ (uma proteína divisão celular bacteriana), a tubulina, e outras macromoléculas foi estudado 25, 26, 27, 28, e observou-se polyhe Dron-como a deformação das membranas GV induzida por encapsulamento de microesferas de 29, 30. Em segundo lugar, as proteínas de membrana pode ser inserida na membrana vesicular por este método, embora com dificuldade 31. Por exemplo, o grupo Yomo usado este método para estudar a síntese in vitro e a actividade formadora de poros de membrana da proteína α-hemolisina 32. Em terceiro lugar, é possível gerar GVs assimétricos em que os componentes lipídicos dos folhetos interior e exterior são diferentes 22. Por exemplo, Whittenton et ai. geradas GVs assimétricas com lipídios catiônicos na folheto interno para encapsular polinucleótidos carregados negativamente, e com lipídios neutros no folheto externo para diminuir a toxicidade e captação celular não específica 33. Em quarto lugar, a fracção de volume e concentração de substâncias no interior dos GVs pode ser relativamente altas = "xref"> 28, 34. Em quinto lugar, múltiplos tipos de materiais podem ser encapsulados 35. Por exemplo, Nishimura et ai. encapsulado um sistema de transcrição-tradução in vitro em GVs e usou o sistema para expressar a proteína fluorescente verde (GFP) na GVs 36. Estas cinco características fazem w / o emulsão centrifugação um método indispensável para a geração de GVs-imitando celulares.
Em trabalhos anteriores, a GVS gerados por centrifugação foram recolhidos por meio de uma seringa equipada com uma agulha 16 G de aço inoxidável longa contendo alguma da solução aquosa final 22. Nas mãos de técnicos inexperientes, este método de coleta poderia facilmente resultar em contaminação do GV com um pouco do óleo. Neste estudo, foi utilizado o w / o protocolo de emulsão centrifugação desenvolvido pelo grupo Yomo 23, 37,em que precipitaram GVs são recolhidos através de um orifício aberto na parte inferior do tubo de centrifugação, em que eles são preparados. Nós preparamos GVs encapsulando 1,0 mm microesferas, que são semelhantes em tamanho a organelas intracelulares. O uso de microesferas permitiu estimar a sua concentração por meio do cálculo da fração de volume. Estabelecimento de um método para a preparação da GVS em que os materiais são densamente é um passo importante para a criação de células artificiais. Para confirmar a utilidade do nosso protocolo de vários tipos de materiais interiores, que também demonstrado que a GFP e um pequeno solúvel em água molécula fluorescente (uranina) pode ser encapsulado nos GVs.
Os pesos específicos do meio de dispersão aquosa interna e da solução aquosa exterior deve ser escolhida com cuidado. Para a W / O emulsão para precipitar na solução aquosa externa, durante a centrifugação, a gravidade específica do meio de dispersão aquosa interior deve ser maior do que a da solução aquosa exterior. Tentámos para preparar soluções utilizando GVs interior e exterior, sem açúcares, mas não obtivemos GVs sob estas condições, porque a solução aquosa interna não tem massa suficiente para atravessar a interferência entre as duas fases. Se houver uma diferença grande pressão osmótica entre as duas soluções, a GVS que precipitam na solução aquosa externa pode encolher ou de ruptura. Por conseguinte, a pressão osmótica no interior e no exterior dos GVs deve ser igual. Para conseguir isso, utilizou-se sacarose como um soluto no interior dispersão aquosa e glucose como soluto na solução aquosa externa; ambos os açúcares foram na mesma concentração. ambos salSS = "refex"> 22 e açúcar 23, 35, 38 foram utilizados para esses fins, mas o açúcar é geralmente empregue porque é menos tóxico e mais solúvel do que o sal. No entanto, se demasiado açúcar é adicionado, os GVs podem entrar em contacto com a parte inferior do vidro de cobertura e colapso. Existem várias estratégias para evitar isso. Uma estratégia é a de reduzir a diferença de gravidade especifica entre as soluções aquosas interiores e exteriores de modo que os GVs precipitam sob condições moderadas; especificamente, o sobrenadante da dispersão GV precipitado pode ser permutado com uma solução que é idêntica à solução aquosa interna para reduzir a possibilidade de ruptura vesicular por adesão ao vidro de cobertura como resultado da flutuação. Outra estratégia consiste em pré-revestimento, tanto vidros de cobertura com uma película fina de lípidos 29.
A preparação apropriada e incubação da emulsão estáimportante. Nós usamos parafina líquida para preparar a solução de óleo. Óleo mineral 26, 31, dodecano 21, 33, e esqualano 33, 39 são também frequentemente utilizados como óleos solventes. Uma vez que estes materiais variam em gravidade específica, a viscosidade e tensão de superfície, diferentes números de vesículas formar-se mesmo quando as mesmas condições de centrifugação são utilizados 33. Para obter as vesículas com as propriedades alvo, que é essencial para optimizar as gravidades e viscosidades das soluções aquosas internas e externas específicos, bem como a preparação acceleration.For centrífuga da fase de óleo, a incubação deve ocorrer a uma temperatura elevada e numa seco ambiente, tal como uma incubadora ou um desidratador. Neste estudo, foram aquecidos a parafina líquida a 80 ° C para dissolver completamente o lípido molecules.In disso, a emulsão deveser preparados única conforme necessário e deve ser imediatamente submetida a centrifugação porque é instável apenas depois de ter sido preparado e a W / O gotículas facilmente fundir um ao outro. A emulsão pode ser preparada em grandes quantidades por sonicação, agitação em vórtice, ou de toques. No entanto, usando um homogeneizador permite a preparação rápida de grandes quantidades de emulsão e mais fácil de emulsificação em óleo com uma alta viscosidade. É também importante que a emulsão ser mergulhado na solução aquosa externa suavemente e rapidamente e em seguida arrefecida a 4 ° C. Para encurtar o tempo entre emulsificação e centrifugação, o sistema de solução aquosa de óleo exterior pode ser pré-arrefecido antes da emulsão é em camadas sobre ele, e todo o sistema pode então ser centrifugado immediately.If a turvação branco aparece mais rápido ou mais lento do que o normal, a mecânica homogeneizador devem ser cuidadosamente lavados para remover detergentes de limpeza. Além disso, antes da emulsif icação, a solução de óleo, solução aquosa interna, e emulsionante deve ser returned até à temperatura ambiente.
aceleração centrífuga adequada também é importante. Por centrifugação a 18000 x g, fomos capazes de preparar GVs com um único material interior encapsulado numa concentração elevada. Quando é necessária a encapsulação de vários materiais, é melhor para reduzir a aceleração centrífuga. Por exemplo, um sistema de montagem de actina encapsular sete compostos foi conseguida com centrifugação a menos do que 350 x g 35. Nos casos em que é indesejável centrifugação, GVs pode ser obtido ajustando a concentração de açúcar ou por precipitação a emulsão sob a influência da sua própria massa 38, 40, 41.
O método aqui relatado tem duas limitações principais. Um é que as moléculas de petróleo (parafina, neste caso) podem ser solubilizados na membrana GV, como já foi apontado por o Weitgrupo z 21. Quando a inserção de uma proteína de membrana na membrana GV é desejada, devem ser considerados os efeitos de moléculas de óleo co-existente na proteína. A outra limitação é a variação de percentagem, em volume. Neste estudo, estimou-se que as fracções em volume de microesferas nos GVs variaram 4-30% em volume; as fracções de volume não eram idênticas à fracção de volume da solução aquosa interna, usado para a preparação GV. Embora nós fomos capazes de encapsular microesferas nos GVs a uma fracção de volume suficientemente elevado para observação microscopia, este método não é adequado para a preparação de GVs com uma fracção do volume de distribuição uniforme. Tem sido relatado que a distribuição das fracções de volume de microsferas muda durante a centrifugação 34.
O método de emulsão centrifugação W / O é comumente utilizado para a formação da GVS contendo materiais encapsulados. No entanto, poucos relatos têm descrito o preparação da GVS encapsulando materiais microescala 34, 42. Recentemente, robôs moleculares que contenham um dispositivo de ADN encapsulado ou um dispositivo molecular foram construídos 43, 44. GVs com compartimentos são a primeira escolha para esses tipos de aplicações; portanto, técnicas, tal como o nosso, que poderiam ser utilizados para a encapsulação de microesferas magnéticas e com microesferas de funcionalização da superfície pode ser diversificada esperado que seja útil 44.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Tomoko Yamaguchi para desenhar a imagem esquemática na Figura 1. Este estudo foi apoiado pelo Projeto Okazaki ORION do Instituto Okazaki for Integrative Bioscience da National Institutes of Natural Sciences (NINS); pelo Centro de Projetos de Astrobiologia (sem AB281010.) de NINS; por um Grant-in-Aid para a Investigação Científica em áreas inovadoras (ordenação dinâmica de sistemas biomoleculares para a criação de funções integradas) da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) (sem 25.102.008.); por um Grant-in-Aid para Jovens Cientistas (B) (para KK, não 15K17850.) a partir JSPS; andby um Grant-in-Aid para a Investigação Atividade Start-Up (para YN, não. 15H06653) a partir de JSPs. Apoio adicional foi fornecido por um subsídio do Instituto Noguchi, uma bolsa da Fundação Kao de Artes e Ciências, e uma bolsa da Água Kurita e Fundação do Meio Ambiente.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |