인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포
Summary
Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.
Abstract
태반은 배아 발생 동안 처음 개발 기관이며, 배아의 생존을 위해 필요하다. 태반이 착상 전 배반포의 여분의 배아 trophectoderm 세포로부터 분화 다양한 융모 세포로 구성되어 있습니다. 이와 같이, 인간 태반의 초기 분화 이벤트에 대한 우리의 이해 때문에 인간 배아의 분리 및 조작에 대한 윤리적, 법적 제한으로 제한됩니다. 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)은 인간 발달을 조사하기위한 견고한 모델 시스템이며 또한 다양한 영양막 세포 유형의 마커를 발현 융모 세포로 생체 외에서 분화 될 수있다. 여기서, 우리는 뼈 형태 형성 단백질 (4) 및 티빈 / 노달 신호 전달 경로의 저해제를 사용하여 세포 내로 융모 hPSCs를 구별하기위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜 된 siRNA로 형질 감염 될 수있는 다양한 영양막 세포 유형을 생성손실의 기능 표현형을 조사 또는 병원균에 감염 될 수있다합니다. 또한, hPSCs는 유전자 변형 될 수 있고, 당시의 기능 이득 분석을 위해 영양막 세포의 전구 세포로 분화. hPSCs부터 인간 trophoblasts를 발생이 체외 분화 방법은 초기 인간 배아 작업의 윤리적 법적 제한을 극복하고,이 시스템은 약물 발견 및 줄기 세포 연구를 포함한 다양한 용도에 사용될 수있다.
Introduction
태반은 임신 중 태아의 성장과 생존에 필요한 산모와 태아 순환 사이의 가스, 영양소, 노폐물, 호르몬의 교환을 용이하게한다. 포유류 배아 발생 동안 형성된 제 기관 6-7 일을 인간 임신 후 생쥐 1, 2, 3, 4 일 3.5-4.5 개발 시작 태반이다. 융모 세포는 태반의 가장 중요한 세포이며, 이러한 세포는 포유 동물 배아의 초기 계통 분화 이벤트 중 하나를 나타낸다. 그들은 착상 전 배반포의 외부 여분의 배아 trophectoderm 세포에서 발생한다. 태반 개발 초기 단계의 우리의 지식은 초기 인간 발달을 모델링에 대한 윤리적, 물류 제한에 의해 제한된다.
배아 이식, trophoblasts 중임산부 상피 세포를 침공하고 전문 전구 세포 (5)로 분화. Cytotrophoblasts (CTBS)의 융합 및 syncytiotrophoblasts (않은 SYN) 및 extravillous 침입 trophoblasts (EVTs)로 분화, 미분화 전구 세포를 단핵하는 앵커 자궁 태반을. 않은 SYN은 임신 유지에 필요한 호르몬을 합성 말기 분화 세포를 다핵 있습니다. 융모 세포에 손상이 유산, 전자 간증, 자궁 내 성장 제한 한 결과로 EVTs 및 않은 SYN을 생성 초기 분화 이벤트는, 태반 형성에 필수적이다. 개발 된 인간 영양막 세포주의 종류 CTBS 태반 호르몬 및 디스플레이 속성 침습 6 생산 융모 상피암를 불멸화 포함한다. 인간의 첫 번째 임신의 태반에서 차 융모 세포는 고립하지만, 세포 빨리 DIF 할 수 있습니다ferentiate 및 체외에서 증식 중지합니다. 중요한 변형 일차 세포주는 종양 및 영양막 불멸화 세포주 정확하게 차 trophoblasts 7 표현되지 않을 수 있음을 나타내는 다른 유전자 발현 프로파일을 갖는다. 또한,이 라인은이 세 번째 학기를 통해 첫 번째 이후의 단계에서 파생되기 때문에 태반의 영양막 세포 줄기 세포 전구 세포를 닮은 않을 것이다.
태반의 형성 및 기능의 초기 사건을 연구하기 위해 초기 단계 인간 trophoblasts의 체외 배양 시스템에서 강력한 필요성이있다. 착상 전 배아의 내부 세포괴와 속성을 공유하는 인간 배아 줄기 세포 (hESCs는)은, 종종 조기 태반의 형성을 포함한 초기 인간 현상을 모델링하기 위해 사용된다. 두 사람의 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 및 hESCs는 뼈 모르를 사용하여 체외에서 trophoblasts로 분화 될 수있다phogenic 단백질 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. BMP4을 이용한 융모 세포로 다 능성 세포의 이러한 변환은 인간 세포에 특이하고 초기 인간 배아 구 (16)에 대한 액세스를 필요로하지 않기 때문에 널리 초기 인간 태반의 개발을 연구하는데 사용된다. 최근에는 발견되었다는 억제제의 첨가 A83-01 (A) 및 된 Smad2 / 3, MEK1 / 2의 신호 전달 경로를 차단 PD173074 (P)는, trophectoderm 같은 조상 주로 않은 SYN으로 hPSC 분화의 효율을 증대 및 중배엽, 내배엽, 또는 외배엽 세포 9, 17의 광범위한 세대가없는 EVTs, </suP>. 십이일 인간 포배 단계의 배아로부터 단리 trophectoderm 세포와 유사한 유전자 발현 프로필을 가지며 각종 태반 특정한 성장 호르몬 분비에 대한 이러한 매질 조건을 이용하여, hESCs는이 시험 관내 모델 시스템 (9), (11)의 유효성을지지 차별화. 여기서는 BMP4 / A / P 배지를 이용하여 인간 전구 세포 영양막에 hPSCs의 생체 외 분화에 대한 상세한 프로토콜을 제시한다. 이러한 조건은 리포 펙션 – 매개 형질 전환을 사용하여 RNA 서열, 유전자 파괴 된 siRNA를 이용하여, 병원체 감염, 유전 적 변형을 포함한 다양한 애플리케이션에 세포 과잉수 생산.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 영양막 세포의 전구 세포로 hESCs는 차별화를위한 기본 단계를 제시했다. 이 프로토콜은 최근 융모 세포의 분화를 증가시키고 통상적 BMP4 단독 치료로 관찰 중배엽 전구 세포의 생성을 방지 빠르게 티빈 / 노달 시그널링 억제제의 추가 hESCs는 차별화하기 위해 최적화되었다. BMP4 모델 시스템은 인간의 영양막 세포 계보 사양 및 확장의 초기 단계의 시험을 허용한다. 또한,이 BMP4 모델 시스템?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.
Materials
| DMEM/F12 | Invitrogen | 11330-057 | |
| Knock Out Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | This is referred to as "serum replacement" in this protocol. |
| NEAA | Invitrogen | 11140-050 | |
| FBS | Invitrogen | 16000-044 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 10828-028 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-155 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7522 | |
| B-FGF | Millipore | GF-003 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105-041 | |
| Collagenase Type IV | Invitrogen | 17104-019 | |
| Rock inhibitor Y27632 | Calbiochem | 688000 | |
| Irradiated CF1 MEFs | GlobalStem | 6001G | MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated. |
| 0.22 um syringe filter | Millipore | SLGS033SS | |
| Heracell 150i low oxygen incubator | Heracell/VWR | 89187-192 | Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient. |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-01M | |
| A 83-01 | R&D Systems | 2939/10 | |
| PD173074 | R&D Systems | 3044/10 | |
| RNAiMax | Invitrogen | 13778150 | |
| Trizol | ThermoFisher | 15596026 | Trizol is used to isolate total RNA. |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol. |
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