Разработка системы доставки Экономичный ДНК по «Acufection» и его применение к исследованию кожи

Кожа является первой линией защиты организма. Кератиноциты (КИС) являются основным типом клеток в коже человека и мышей. В ответ на раздражители окружающей среды (например , солнечного света, кислорода, химических веществ и патогенные вторжения), KCS активируются и производить широкий спектр провоспалительных цитокинов и хемокинов , таких как IL-8, IL-6, IL-1 & alpha ; , IL-1, TNF- α и GM-CSF , ^1. Вместе они вызывают набор иммунных клеток к коже. Усугубляется кожное воспаление часто связано с многочисленными человеческими заболеваний , включая острый внематочной контактный дерматит и хронический Т клеточного воспаления (например , аллергический контактный дерматит и псориаз) ^2. Плавное провоспалительные реакции в коже путем ингибирования активации KC является правдоподобным подход для лечения кожного воспаления. Этот протокол описывает новый подход к транзиторна экспрессии гена цитокина в эпидермисе с целью изучения иммунного РезаПонс косвенного такой обработки в коже.

Эпидермис сочиняет наиболее поверхностный слой кожи. Он служит в качестве физического барьера, сохраняя внешние вещества, такие как нуклеиновые кислоты и патогенов от входа в более глубокие слои кожи. Несколько безыгольных методы были созданы для передачи эпидермального ДНК ^{3, 4.} ДНК в растворе или связанный с катионными липосомами или аденовирусными векторами были непосредственно применены к эпидермису, модифицированный методы, таким как удаление рогового слоя или обработка эпиляции реагента. Удаление рогового эпителия способствует ДНК пересечения эпидермальный барьер и взаимодействие с кератиноциты и клетки Лангерганса , чтобы вызвать иммунный ответ ^5. В то время как большая площадь поверхности для переноса ДНК, и этот подход не включает в себя иглу, есть недостатки, включая требованиедля больших количеств ДНК (10 – 100 мкг), грубого обращения на кожу путем отгонки, и противоречивые результаты в индукции иммунного ответа у иммунизированных животных без доставки ДНК усилител ^6. Микрочастицы опосредованных внутриклеточная доставка голой ДНК к коже была показана, высокой эффективность и воспроизводимость для индукции иммунного ответа ^{7, 8.} Ручная генная пушка была использована для бомбардировки целевого участка кожи с плазмидной ДНК , покрытые частицами золота 2 мкм диаметра по размеру с помощью гелия под давлением воздуха потока ^9. Плазмидная ДНК предположительно поглощается KCsand дендритных клеток (ДК) в коже и белки локально выраженная или транспортируются в дренирующие лимфатических узлы с помощью ДК ^10. Хотя система генной пушки проста и требует ограниченного технического опыта, расходы на подготовку и доставку "ДНК булпусть "(т.е. золотых порошков, газообразный гелий) и для генной пушки сами ограничивают его общее применение. Кроме того, потребность в систему доставки газообразного гелия ограничивает легкость генной пушки транспорта , когда эксперименты проводятся в разных местах. Microseeding было показано , что достичь более высокой эффективности переноса генов , чем одной инъекции и бомбардировок частиц ^11. Microseeding использует татуировку пистолет для доставки ДНК на кожу без использования шариков частиц ^11. Качающийся микроигло на коже , используя этот подход, скорее всего, непосредственно скрести клеточную мембрану и, таким образом, перенос ДНК в нескольких ячеек одновременно. тем не менее, боль, связанная с большим количеством инъекций с иглами мм диаметра 0.254 является недостатком.

Здесь мы предлагаем альтернативный подход к доставке ДНК в естественных условиях. «Acufection» </strОнг> Протокол мы описали здесь обеспечивает экономичный и эффективный способ доставки плазмидной ДНК в коже мышей. Вкратце, десять акупунктурные иглы (диаметром 0,2 мм х 13 мм в длину) были связаны в пучок с помощью клейкой ленты. Объем 10 мкл PBS с 10 мкг плазмидной ДНК, содержащей трансген интерес был помещен на бритой, депиляции кремом обработанной боковой поверхности кожи. С помощью пучка акупунктуры иглы вибрировать поверхность (1 см х 1 см) кожи, кератины в роговом слое были ослаблены и плазмидная ДНК наносила на поверхность была поглощена в эпидермис. Повреждение кожи контролировалась и оказался минимальным. Экспрессия гена, трансфицированной в acufected кожи была подтверждена как количественной ПЦР в реальном времени (QRT-PCR) и ELISA. Иммунные модулирующие эффекты acufection доставляемых IL-15ΔE7 на кожном воспалении были продемонстрированы с использованием IMQ обработанной модели мыши ^12. В то время как acufection оказывается простым и менее Демаметод nding для доставки ДНК в естественных условиях, оптимальное количество ДНК для различных генов и времени , чтобы проколоть кожу должно быть тщательно оптимизировано , чтобы получить воспроизводимые результаты.