إعادة بناء واسعة النطاق والمستقل، تجميع غير متحيز واستنادا المورفولوجية المقاييس لتصنيف الخلايا العصبية في الانتقائي السكان
Summary
يصف هذا البروتوكول إعادة البناء على نطاق واسع من السكان العصبية انتقائية، وصفت بعد الإصابة الوراء مع فيروس داء الكلب المعدلة ويعبرون عن علامات الفلورسنت، ومستقلة، مجموعة مشاركات التحليلات التي تمكن توصيف شامل من المقاييس المورفولوجية بين الفئات الفرعية العصبية متميزة.
Abstract
ويحدد هذا البروتوكول إعادة البناء على نطاق واسع من الخلايا العصبية جنبا إلى جنب مع استخدام التجميع مستقلة وغير منحازة التحليلات لإنشاء مسح شامل لالخصائص المورفولوجية لوحظ بين السكان العصبية انتقائية. الجمع بين هذه التقنيات يشكل نهجا رواية لجمع وتحليل البيانات تشريحي عصبي. معا، وتمكن هذه التقنيات على نطاق واسع، وبالتالي أكثر شمولا، وأخذ عينات من السكان العصبية انتقائية وتحدد الأساليب الكمية مشاركات لوصف الطبقات العصبية فريدة شكليا ضمن مجموعة من السكان.
يحدد البروتوكول استخدام فيروس داء الكلب المعدلة لتسمية انتقائي الخلايا العصبية. G-حذف أفعال فيروس داء الكلب مثل التتبع الوراء بعد الحقن التجسيمي في بنية الدماغ الهدف من الفائدة وبمثابة وسيلة لإيصال والتعبير عن EGFP في الخلايا العصبية. يصاب عدد كبير من الخلايا العصبية باستخدام هذاتقنية والتعبير عن GFP طوال التشعبات، وإنتاج يملأ كاملة من الخلايا العصبية الفردية "جولجي مثل". وفقا لذلك، ويحسن طريقة تتبع الوراء بوساطة فيروس على تقنيات تتبع الوراء التقليدية قائم على الأصباغ التي تنتج يملأ داخل الخلايا كاملة.
ويتم اختيار الفردية الخلايا العصبية معزولة جيدا تغطي جميع مناطق منطقة الدماغ تحت الدراسة لإعادة الإعمار من أجل الحصول على عينة تمثيلية من الخلايا العصبية. يحدد البروتوكول إجراءات لإعادة بناء أجسام الخلايا وإكمال أنماط تشجر شجيري من الخلايا العصبية المسماة تمتد أقسام الأنسجة المتعددة. يتم استخراج البيانات الشكلية، بما في ذلك مواقف كل الخلايا العصبية داخل بنية الدماغ، لمزيد من التحليل. واستخدمت وظائف البرمجة القياسية لأداء مجموعة مستقلة التحليلات والتقييمات العنقودية على أساس المقاييس المورفولوجية. للتحقق من جدوى هذه التحليلات والتقييم الإحصائي لPERFO التحليل العنقوديrmed على 160 الخلايا العصبية بناؤها في النواة الشبكية المهادية من المهاد (TRN) من قرد المكاك كان. كل من التحليل العنقودي الأصلي والتقييمات الإحصائية يؤديها هنا تشير إلى أن يتم فصل الخلايا العصبية TRN إلى ثلاث مجموعات سكانية فرعية، لكل منها خصائصها المورفولوجية فريدة من نوعها.
Introduction
التشريح هي واحدة من أسس علم الأعصاب 1 والفائدة الأخيرة في "connectomics" جددت الحماس لفهم التنوع الصرفي من السكان العصبية والروابط بين الخلايا العصبية الخاصة 2. طرق لوضع العلامات والخلايا العصبية إعمار قد تحسنت بشكل كبير مع الابتكارات الحديثة، بما في ذلك وراثي وبوساطة فيروس تتبع الدائرة النهج 3، 4، تمكين استطلاعات المورفولوجية أشمل من السكان العصبية 5. وبالإضافة إلى التحسينات في وصفها الخلايا العصبية الفردية، وظهرت تقنيات تحليل البيانات الكمية أيضا أن تتيح تصنيف مستقل وغير متحيز من الخلايا العصبية في مجموعات سكانية فرعية مختلفة تعتمد على البيانات المورفولوجية 5، 6. هذه التقنيات مشاركات هي تحسنا على أكثر التقليديهل أساليب تصنيف النوعية التي كانت المعايير في هذا المجال لأكثر من قرن. الهدف من هذه الدراسة هو تحديد، خطوة بخطوة، ومزيج من العلامات بوساطة الفيروس من الخلايا العصبية داخل الكتلة السكانية انتقائية، إعادة البناء على نطاق واسع لعينة شاملة من هذه الخلايا العصبية، وتحليل البيانات الكمية على أساس تجميع مستقل مع التقييم الإحصائي. من خلال الجمع بين هذه الأساليب، ونحن الخطوط العريضة لنهج جديد تجاه جمع وتحليل البيانات تشريحي عصبي لتسهيل أخذ العينات شاملة وتصنيف غير متحيز من أنواع الخلايا العصبية فريدة شكليا ضمن مجموعة من السكان العصبية انتقائية.
وكمثال على هذه الأساليب، وصفنا تحليلنا لعدد كبير من الخلايا العصبية في قطاع واحد من النواة الشبكية المهادية (TRN) من قرد المكاك. وهذه البيانات هي من دراسة مسبقة 7. طرق لوصفها بشكل انتقائي الخلايا العصبية TRN إسقاط لlatera الظهريةل الركبي نواة المهاد (dLGN) باستخدام حقن الجراحي لفيروس داء الكلب تعديل ترميز EGFP 4، 8 (انظر الجدول مواد معينة / المعدات، الصف 2) تم تفصيلها. هذا فيروس داء الكلب المعدلة ويفتقر إلى الجينات ترميز بروتين معطف أساسي، والقضاء على الحركة عبر متشابك من الفيروس. وبمجرد أن يدخل الفيروس محطات محوار في موقع الحقن، أنه يتصرف مثل التتبع الوراء التقليدي مع فائدة هامة من القيادة التعبير EGFP في جميع أنحاء تشجر شجيري كامل من الخلايا العصبية المصابة 5، 9، 10. وفقا لذلك، وهذا فيروس داء الكلب-حذف G يمكن استخدامها لتصيب بشكل انتقائي وتسمية أية مجموعة من السكان الخلايا العصبية بعد الحقن ونقل إلى الوراء.
من أجل إجراء تحليل شامل للسكان العصبية محددة، من المهم أخذ عينات منتوزيع واسعة من الخلايا العصبية في أوساط السكان. لأن تقنية وضع العلامات بوساطة فيروس تنتج داخل الخلايا كاملة "، جولجي مثل" تملأ العديد من الخلايا العصبية مع المحاور في موقع الحقن الفيروس، فمن الممكن لإعادة عينة كبيرة جدا من الخلايا العصبية في المدى الكامل للبنية الدماغ. بالإضافة إلى ذلك، لأن فيروس داء الكلب المعدلة وفعال جدا في إصابة وصفها أعداد كبيرة من الخلايا العصبية، فمن الممكن لإعادة بناء مئات من الخلايا العصبية في الحيوانات. وترد إجراءات أخذ العينات 160 الخلايا العصبية في جميع أنحاء قطاع المرئي للسندات ذات عائد مستهدف 11 من أجل توليد عينة شاملة من dLGN-إسقاط الخلايا العصبية TRN. وصفت عملية إعادة بناء الخلايا العصبية الفردية باستخدام نظام إعادة الإعمار الخلايا العصبية بما في ذلك المجهر، وكاميرا، وبرنامج إعادة الإعمار. كما وصفت هي الطرق لتحديد مواقع الخلايا العصبية الفردية داخل بنية الدماغ (في هذه الحالة داخل TRN) والتحقق من فيروس حقن الاعتصامحجم البريد والمكان ضمن هيكل (في هذه الحالة داخل dLGN) باستخدام عمليات إعادة البناء كفاف الحجمي. الخطوات لتصدير البيانات المورفولوجية وتنفيذ مجموعة مستقلة التحليلات على أساس ترد المقاييس المورفولوجية قياس لكل الخلايا العصبية. هناك قيود على طرق التجميع وهناك أيضا مجموعة متنوعة من خوارزميات التجميع المختلفة المتاحة. وفقا لذلك، يتم وصف هذه الخيارات وفوائد بعض خوارزميات أكثر شيوعا. والتحليل العنقودي لا توفر التحقق الإحصائي للتفرد مجموعات. لذلك، تم تفصيلها خطوات إضافية للتحقق من تجميع الأمثل فضلا عن العلاقات بين البيانات الشكلية داخل وعبر مجموعات. يتم تجميع الأساليب الإحصائية لتقييم مجموعات لمجموعة البيانات ذات العائد المستهدف للتأكد من أن الخلايا العصبية TRN إلى ثلاث مجموعات فريدة من نوعها تقوم على موصوفة 10 المقاييس المورفولوجية مستقلة.
وبالتالي، من خلال تحديد الخطوات لوضع العلامات بشكل انتقائي، وإعادة بناء وتحليل البيانات المورفولوجية من السكان العصبية محددة، ونحن تصف أساليب لقياس الاختلافات الشكلية بين الخلايا العصبية داخل الكتلة السكانية. وأكدت نتائج مسبقة من أنواع الخلايا العصبية واضحة في القطاع البصري للTRN قرد المكاك مع أساليب تقييم إحصائية منفصلة. معا، ونحن نأمل أن تكون هذه التقنيات تكون قابلة للتطبيق على نطاق واسع لمجموعات البيانات تشريحي عصبي وتساعد على إنشاء تصنيف الكمي للتنوع السكان العصبية من خلال الدماغ.
Protocol
Representative Results
Discussion
ظلت الدراسات تشريحي عصبي أحد أعمدة علم الأعصاب والفائدة الأخيرة في connectomics والعلاقات هيكل الوظائف وجدد الحماس لالتوصيف المورفولوجي مفصل من السكان العصبية انتقائية. تقليديا، وقد اعتمدت الدراسات تشريحي عصبي في التصنيفات النوعية من الخلايا العصبية إلى طبقات متميزة ش?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر الدكاترة. إد كلوي ومارتي Usrey على إتاحة الفرصة لنا لاستخدام الأنسجة أعدت كجزء من دراسة سابقة وليبي Fairless وشياوان الباحث ليو للمساعدة في إعادة بناء الخلايا العصبية. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (نيى: EY018683) ومؤسسة وايت هول.
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
References
- Cajal, S. R. y. . Histologie du systeme nerveaux de l’homme et des vertebres. , (1911).
- Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
- Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
- Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
- Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
- Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
- Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).
- Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
- Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
- Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
- Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
- Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).
- Thorndike, R. L. Who belongs in the family?. Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
- Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
