JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

المصدر المفتوح تحليل عالية المحتوى الاستفادة الآلي الإسفار مدى الحياة التصوير المجهري

Published: January 18, 2017
doi:
10.3791/55119
, , , , , , , , , , , , , , , , , , ,
1Photonics Group, Department of Physics,Imperial College London, 2Institute for Chemical Biology, Department of Chemistry,Imperial College London, 3MRC Clinical Sciences Centre,Hammersmith Hospital, 4Chemical Biology Section, Department of Chemistry,Imperial College London, 5Retroscreen Virology Ltd, 6Pfizer Global Research and Development,Pfizer Limited, Sandwich, Kent, UK, 7Centre for Histopathology,Imperial College London

Summary

نقدم ارتفاع محتواها أداة مفتوحة المصدر تحليل (HCA) باستخدام آلية التصوير مضان عمر (FLIM) لمعايرة تفاعلات البروتين باستخدام فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) قراءات مقرها. يتم التحكم والحصول على البيانات لهذا الصك openFLIM-HCA من قبل البرامج المكتوبة في μManager وإجراء تحليل البيانات في FLIMfit.

Abstract

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions using Förster resonance energy transfer (FRET) based readouts of fixed or live cells in multiwell plates. This provides a means to screen for cell signaling processes read out using intramolecular FRET biosensors or intermolecular FRET of protein interactions such as oligomerization or heterodimerization, which can be used to identify binding partners. We describe here the functionality of this automated multiwell plate FLIM instrumentation and present exemplar data from our studies of HIV Gag protein oligomerization and a time course of a FRET biosensor in live cells. A detailed description of the practical implementation is then provided with reference to a list of hardware components and a description of the open source data acquisition software written in µManager. The application of FLIMfit, an open source MATLAB-based client for the OMERO platform, to analyze arrays of multiwell plate FLIM data is also presented. The protocols for imaging fixed and live cells are outlined and a demonstration of an automated multiwell plate FLIM experiment using cells expressing fluorescent protein-based FRET constructs is presented. This is complemented by a walk-through of the data analysis for this specific FLIM FRET data set.

Introduction

ويكمل الاستخدام المتزايد للتحليل المحتوى العالي الآلي (HCA) في اكتشاف الأدوية 1 إلى المكتبات مجمع فحص من قبل الاتجاه في علوم الحياة البحوث الأساسية نحو تجارب التصوير الآلي للدراسات منهجية، على سبيل المثال، لشاشات المظهرية المكتبات سيرنا. أصبحت HCA الآلي أيضا ذات أهمية متزايدة للدراسات على نطاق والبيولوجية الصغيرة التي تم تنفيذها عادة مع التجارب اليدوية مع عشرات من الأطباق الخلايا المصورة مع المجاهر التقليدية. قوة الإحصائية التي يمنحها القدرة لفحص وتحليل مئات الآلاف من مجالات رأي تمكن المتوسط ​​من ضجيج التجريبية (بما في ذلك "الضوضاء البيولوجي") وأتمتة الحصول على البيانات صورة وتحليل المصفوفات عينة كبيرة يمكن أن تساعد في القضاء على عامل التحيز، وغالبا ما يمكن استخدامها للكشف عن وقوع الأخطاء المنهجية، مثل تغيير في التشكيل IRF خلال عملية استحواذ. المقايسات مضان القائمتنفذ على نطاق واسع في HCA، مع معظم المتاحة تجاريا HCA الأجهزة تتميز مضان كثافة التصوير في واحد أو أكثر من القنوات الطيفية لتعيين التوزيع النسبي وشارك في توطين البروتينات المسمى. لا تستغل طرائق التصوير مضان أكثر تطورا، مثل التصوير مضان عمر (FLIM)، الاستقطاب التصوير تباين وحل وقت التصوير مضان تباين، على نطاق واسع في الصكوك HCA التجارية، على الرغم من أنها توفر قراءات الكمية قوية، على سبيل المثال، من تفاعلات البروتين. هنا نقدم مقاربة مفتوحة المصدر لتنفيذ FLIM في المجهر الآلي للأمازيغية.

يوفر مضان عمر قراءات الطيفية ratiometric بطبيعتها التي يمكن استخدامها للتمييز بين الأنواع الجزيئية المختلفة أو للتحقيق في بيئة الجزيئية المحلية من fluorophore وغير حساس لتركيز fluorophore، إلى الكفاءة الإثارة / الكشف، وتأثير scatteحلقة وعينة امتصاص 2. وعلاوة على ذلك، منذ قياسات مضان عمر يمكن أن يتم في قناة الطيفية واحدة، وتكون قابلة للمقارنة مباشرة بين الصكوك وعينات مختلفة دون معايرة. ويمكن تطبيقها على fluorophores الذاتية، بما في ذلك بعض نواتج الأيض الخلوي، والدهون والمكونات المصفوفة خارج الخلية، لتقديم قراءات الجوهرية من العمليات البيولوجية والأمراض. وهكذا FLIM خالية من التسمية يمكن تعيين التغيرات الأيضية في الخلايا 3،4، وقد تم تطبيقها على رصد الخلايا الجذعية التمايز 5،6 ونمو السقالات الكولاجين 7. نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن FLIM HCA يمكن استخدامها لفحوصات التسمية خالية الآلي للالأيض الخلوي باستخدام تألق ذاتي 8. أكثر شيوعا، ولكن، يتم تطبيق القياسات مضان مدى الحياة، وFLIM إلى fluorophores الخارجية التي تسمية الجزيئات الحيوية محددة، وغالبا ما تنفذ باستخدام الأصباغ التي وصمة عار مقصورات الخلوية، وذلك باستخدام الأصباغ بالإضافة إلى antibodieالصورة التي تستهدف بروتينات معينة في الخلايا الثابتة، أو باستخدام fluorophores أعرب وراثيا بالإضافة إلى بروتينات معينة. عمر مضان يمكن استخدامها لتقديم قراءات الكمية قوية من تحقيقات الفلورسنت استشعار البيئة المادية أو الكيميائية. فعلى سبيل المثال، تم نشر الأصباغ لاستشعار مرحلة الدهون المحلية أغشية الخلايا 9 أو اللزوجة خلية 10، وأعرب عن راثيا أجهزة الاستشعار القائمة على بروتين فلوري تم تطويرها لتقرير تركيزات من الخلايا الجزيئات مما يشير بما في ذلك IP3 11، PIP2 12 و calpain 13 أو أيونات مثل الكالسيوم 14،15، والبوتاسيوم 16 وكلوريد 17.

العديد من هذه المجسات الحيوية تستخدم نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) 18،19 لتقديم قراءات للتغيرات في التشكل جهاز الاستشعار البيولوجي. الحنق بين "المانحة" وfluorophores "متقبل" يحدث عبر قصيرة المدى التفاعل المباشر ثنائي القطب-ثنائي القطبالتي عادة ما يتم فصل fluorophores بنسبة أقل من ~ 10 نانومتر. وبالتالي الكشف عن الحنق يدل على مقربة من البروتينات وصفت بشكل مناسب، وبالتالي يوفر وسيلة لقراءة تفاعلات البروتين البروتين 20، مثل ملزمة أو oligomerization – إما نقطة نهاية في خلايا ثابتة أو الأحداث كما ديناميكية في القياسات مدار الساعة من العيش الخلايا. التي وصفها لبناء الجزيئي المناسب مع كل من الجهات المانحة وfluorophores متقبل، فمن الممكن أيضا أن يتلو التغييرات متعلق بتكوين – أو انشقاق – للبناء عن طريق التغيير في الحنق وهذا هو الأساس للعديد من أجهزة الاستشعار 21. يمكن قياس كفاءة الحنق تقديم معلومات عن المسافة بين المانحين ومتقبل وجزء من السكان fluorophores المانحة تمر الحنق. وهكذا، وتقنيات التصوير أساس الحنق ويمكن استخدامها لتعيين وquantitate التفاعلات الجزيئية في المكان والزمان، على سبيل المثال، لتوضيح الإشارات الخلوية العمليات 22. المطعم الاليجي تقنيات التصوير مثل هذه يمكن أن توفر فحوصات إنتاجية عالية بناء على قراءات من مسارات الإشارات أو الشبكات.

في HCA، قراءات الحنق تنفيذها الأكثر شيوعا هي التصوير الطيفي ratiometric، حيث يتم تعيينها التغييرات في نسبة متقبل لشدة المانحة. في حين يتم تنفيذ هذا النهج بسهولة – وتتوفر في العديد من القراء لوحة multiwell المتاحة تجاريا – قياسات الحنق الكمية الطيفي تتطلب معايرة الاستجابة الطيفية لنظام 23. وهذا يشمل الطيفي عبر الحديث الناشئة من الأطياف تنزف من خلال والإثارة المباشرة للمتقبل فضلا عن خصائص الإرسال من الصك وعينة (تأثير فلتر الداخلي). من حيث المبدأ، وهذا ينطوي على قياس عينات إضافية "السيطرة" التي وصفت مع أي من الجهات المانحة فقط أو متقبل فقط.

من هذه القياسات الطيفية الحنق ratiometric، والحنق فعالالكفاءة (المنتج من الحنق الكفاءة الفعلية وجزء من FRETing جزيئات المانحة / متقبل) ويمكن الحصول على جنبا إلى جنب مع الحصة النسبية من الجهات المانحة ومتقبل الجزيئات 24. وكثيرا ما يستخدم الحنق ratiometric الطيفي مع أجهزة الاستشعار الحنق unimolecular، حيث رياضيات الكيمياء المانحة / متقبل يمكن افتراض أن تكون معروفة. لتحديد الكسور سكان المانحة FRETing ومتقبل، على سبيل المثال، للحصول على منحنى الاستجابة للجرعة، مطلوب معرفة كفاءة الحنق الفعلية. ويمكن الحصول على ذلك عن طريق قياس عينة إيجابية تحكم الحنق مع الخصائص المعروفة أو باستخدام طريقة مختلفة لقياس كفاءة الحنق، مثل photobleaching من متقبل أو FLIM.

باستخدام قراءات مضان مدى الحياة، والحنق ويمكن الكشف عن وكميا بواسطة قياسات الانبعاثات المانحة وحدها – إزالة الحاجة للمعايرة الأطياف ومزيد من عينات السيطرة. وهكذا، قراءات FLIM الحنق يمكن مقارنة بين الصكوكوبين عينات مختلفة – السماح البيانات من التنظير أو التصوير المقطعي نماذج المرض الحية 25 ليتم مقارنتها مع القياسات من المقايسات خلية القاعدة. من المناسب ملامح الاضمحلال مضان المانحة إلى نموذج تسوس متعددة الأسي المناسب الموافق FRETing وFRETing غير السكان المانحة، الحنق الكفاءة وكسور السكان يمكن، من حيث المبدأ، يمكن الحصول عليها مباشرة من دون مزيد من القياسات. هذه المزايا الهامة، ومع ذلك، وتأتي على حساب FLIM تتطلب الفوتونات أكثر الكشف لكل بكسل من التصوير كثافة الطيفي – عادة مئات من الفوتونات المطلوبة لتحقيق الدقة في تحديد العمر من 10٪ عند تركيب لنموذج الاضمحلال الأسي واحد، وعندما تركيب لمحات مضان تسوس إلى (تسوس multiexponential) نماذج معقدة، وعدد من الفوتونات الكشف يتطلب زيادات إلى الآلاف. وقد أدى هذا تقليديا لمدة التحصيل طويلة (عشرات ومئات من ثانية لكل مجال السادسمصريات) لFLIM، وخاصة عند استخدام الوقت المترابطة العد فوتون واحد (TCSPC) نفذت مع اكتساب بكسل متتابعة في المجاهر المسح بالليزر. محاولات لزيادة سرعة التصوير باستخدام شدة الإثارة أعلى يمكن أن يؤدي إلى photobleaching من و / أو الضيائية كبير. جنبا إلى جنب مع عدم وجود أدوات الأجهزة والبرمجيات المناسبة المتاحة تجاريا، وقد أعاق هذا FLIM من يجري استخدامها في HCA لاكتشاف الأدوية أو بيولوجيا الأنظمة، حيث مئات الآلاف من الحقول نظر هي للتصوير. وقد تم تنفيذ المسح بالليزر TCSPC FLIM في لوحة multiwell المجهر الآلي 26 للقياسات الثانوية التالية تحديد "يضرب" التي كتبها ثابتة للدولة، حل الاستقطاب مضان تباين التصوير 27، والتي يمكن أن تصل إلى سرعات التصوير مماثلة لطيفي التصوير ratiometric 28 التي تشترك معها العديد من المزايا والعيوب. التصوير مضان تباين يستغل النقصفي تباين مضان من متقبل في وجود الحنق وأيضا حساسة للالطيفي عبر الحديث (على سبيل المثال، الإثارة المباشرة للمتقبل). فهو يتطلب معايرة لحساب الاستقطاب عبر الحديث ولا يوفر القياس المباشر من الكفاءة الحنق.

لتحقيق مزايا FLIM للأمازيغية، ونحن نعمل على معالجة قضايا سرعة الحصول على الصور وزيادة فرص الوصول إلى التكنولوجيا. هنا، ونحن نقدم على قائمة كاملة من مكونات برمجيات المصدر والأجهزة المفتوحة التي يمكن استخدامها لتنفيذ السريع فليم قارئ لوحة multiwell الآلي الموضح أدناه، جنبا إلى جنب مع الحنق قدوة المقايسات مقرها. في نهجنا 29، وأدرك FLIM باستخدام واسعة المجال التصوير بوابات الوقت باستخدام بوابات الصورة البصرية المكثفة (الحكومة الإسرائيلية)، الذي هو موضح في الشكل (1) التي يمكن أن توفر أسرع معدلات التصوير وانخفاض photobleaching من من واحد شعاع المسح TCSPC نظرا ل مواز interr بكسلogation. أداتنا openFLIM-HCA يمكن أن توفر FLIM غير خاضعة للرقابة، الأمر الذي يتطلب سوى بضع ثوان للحصول على البيانات FLIM الكشف عن عدد قليل من 100 الفوتونات لكل بكسل (اعتمادا على سطوع من العينة). جنبا إلى جنب مع الوقت اللازم لنقل عينة من الحقل السابق للعرض، لضبط إعدادات اكتساب والحفاظ على العينة في التركيز، وهذا ينتج عادة في مدة التحصيل لوحة multiwell من ~ 10 ثانية لكل مجال الرؤية 25،28. يمكن تنفيذها باجتزاء البصرية باستخدام شبه واسع المجال نيبكو ( "القرص الغزل") الماسح الضوئي 30.

لتحليل البيانات فليم، قمنا بتطوير أداة البرمجيات مفتوحة المصدر ودعا FLIMfit 31 أن يكون قادرا على تحليل بسرعة multiwell قواعد البيانات لوحة FLIM على محطات عمل الكمبيوتر التقليدية وهو أحد المكونات في لميرو 32. يوفر FLIMfit قدرات التحليل العالمية (التي نوقشت في القسم 1.2) التي تمكن البيانات فليم التي سيتم تركيبها على نماذج معقدة مع سنلي بضعة 100 الفوتونات لكل بكسل في ظل افتراض أن المكونات مضان حياة هي ثابتة عبر صورة أو المنطقة ذات الاهتمام (ROI)، وبالتالي تخفيض عدد الفوتونات الكشف المطلوبة، والتعرض للضوء لعينة وقت والحصول على الصور. تشغيل FLIMfit على أجهزة الكمبيوتر المكتبية القياسية، ويتطلب فقط 10S ثوان من الوقت الحسابي لتحليل مجموعات البيانات التي تضم مئات FOVs. وهكذا كل من الحصول على البيانات فليم وتحليل يمكن القيام بها على فترات زمنية عملية للأمازيغية.

الأجهزة openFLIM-HCA

ويتكون لدينا تنفيذ HCA FLIM ستة عناصر رئيسية هي: (ط) إطار المجهر مضان مع ضبط تلقائي للصورة البصرية. (ب) وبمحركات (XYZ) مرحلة المجهر. (ج) مصدر الليزر الإثارة. (د) وبوابات الزمن مجالا واسعا نظام FLIM مع تكثيف مسور البصرية (الحكومة الإسرائيلية)، مولد تأخير والكاميرا. (ت) جهاز كمبيوتر للحصول على البيانات وتحليلها و(السادس) قرص الماسح الضوئي نيبكووحدة للتصوير مقطوع بصريا لقمع من ضوء التركيز. وهذا يمكن أن تكون مهمة عند التصوير إشارات ضعيفة، على سبيل المثال، من أجهزة الاستشعار الحنق في غشاء الخلية البلازما، التي يمكن ان تغرق من مساهمات مضان حشوية أو الخلفية من coverslips أو مستنبت. يتم الحصول على البيانات FLIM بوابات الوقت من خلال إلقاء الضوء على عينة مع القصر نابض الإشعاع الإثارة، تصوير الانبعاثات مضان إلى ضوئي من الحكومة العراقية والحصول على سلسلة من الصور CCD من الفوسفور من الحكومة العراقية لمجموعة من إعدادات تأخير وقت بوابة المكثفة البصرية بعد وصول النبضات الإثارة. كما يتم زيادة الوقت بوابة تأخير التالية الإثارة، يعتبر إشارة مضان لخفض وسلسلة من مضان الصور كثافة بوابات الوقت حصلت على اتفاقية مكافحة التصحر تشكل مجموعة البيانات المطلوبة لتحليل الشخصية تفسخ جميع fluorophores في مجال الرؤية . مزامنة النابضة من الحكومة العراقية إلى نبضات الإثارةو، لسلسلة من عمليات الاستحواذ CCD، يتم تعيين تأخير الوقت بوابة نسبة إلى نبضات الإثارة إلى سلسلة من زيادة القيم على نطاق المطلوب. ويتحقق هذا التزامن باستخدام مولد التأخير الذي يضم "مربع سريع تأخير" (توفير التأخير تصل إلى 20 نانو ثانية في 1 الخطوات PS) و "مربع تأخير الخشنة" التي توفر التأخير مع خطوة لا تقل عن 25 ملاحظة.

لFLIM، الإثارة يمكن أن تقدمها أي ليزر فائق السرعة. للراحة، ونحن توظيف عادة ما يكون مصدر supercontinuum ضخ الألياف الليزر التي توفر البقول بيكو ثانية الانضباطي عبر الطيف المرئي من التي يمكن اختيارها للإشعاع الإثارة المناسب لأي fluorophore باستخدام عجلة تصفية الآلية مع مختلف مرشح تمرير النطاق. عادة، ونحن نستخدم متوسط ​​قوة ~ 100-200 مللي واط في العينة مع البقول في معدل تكرار 40 أو 60 ميغاهرتز. ويمكن أيضا أن توفر القوى الإثارة هذه من مصادر الليزر فائق السرعة على أساس مضاعفة ترددتخوض وضع التيتانيوم مخدر ليزر الياقوت. لاحظ أن مدة النبضة الإثارة أدناه ~ 100 PS غير كافية لمعظم التجارب. يتم استخدام عجلة تصفية الآلية الثانية مزودة بمرشحات الكثافة محايدة لتنظيم شدة الإثارة. للسلامة والراحة، ويمكن تسليم الإشعاع الإثارة عن طريق الألياف البصرية وضع واحد. وترد تكوينات FLIM واسعة المجال وFLIM مقطوع بصريا في الشكلين 2 و 3 على التوالي. لمزيد من التفاصيل من المكونات الدقيقة و، يرجى زيارة يكي openFLIM-HCA 33. ويتم إعطاء نسخة من قائمة أجزاء الحالية في المواد التكميلية.

لFLIM واسعة المجال، يطلب من الإشعاع الإثارة لإلقاء الضوء على المجال الكامل للرأي كما موحد ممكن. لهذا نوجه شعاع الإثارة ليزر لالناشر الثلاثية الأبعاد "أعلى قبعة" التي يتم تدويرها في 10-50 هرتز إلى الوقت المتوسط ​​لطخة الليزر، مع الطائرة من DIFفوزر يجري تصويره لطائرة الوصل الخلفي للعدسة المجهر موضوعية. يتم ترحيل صورة مضان من منفذ إخراج المجهر على ضوئي من الحكومة العراقية والفوسفور من الحكومة العراقية (منطقة نشطة قطري 18 ملم) يتم تصويرها على جهاز الاستشعار لاتفاقية مكافحة التصحر العلمية تبريد (حجم رقاقة 10.2 مم × 8.3 مم) الكاميرا باستخدام زوج من العدسات كاميرا توفير التكبير من 0.7. يتم التحكم في النظام عن طريق جهاز كمبيوتر القياسية التي ربطه إلى الأجهزة باستخدام بروتوكولات RS232. وبالإضافة إلى ذلك، يتم استخدام المعالجات الدقيقة اردوينو للسيطرة على مصراع في مسار ضوء الإثارة التي أغلقت إلا عندما تكون الكاميرا CCD تكتسب البيانات فليم وتسجل على اشارة من الثنائي الضوئي الذي يستخدم لقياس متوسط ​​القوة من supercontinuum تصفيتها طيفيا مصدر الإثارة. لFLIM مقطوع بصريا، ويقترن الإشعاع الإثارة الليزر في الألياف الضوئية الحفاظ على الاستقطاب أحادية النمط الذي يربط مباشرة إلى وحدة نيبكو القرص الضوئي، كما قhown في الشكل (3). يتم ترحيل الناتج صورة مضان من وحدة الماسح الضوئي نيبكو على ضوئي من الحكومة العراقية وبقية النظام هو نفسه لFLIM واسعة المجال.

برنامج openFLIM-HCA

هو مكتوب في البرنامج الحصول على البيانات في μManager 34. ويوفر HCA كامل الوظائف الحصول على البيانات بما في ذلك خيارات لتغيير التسلسل الذي يتم تصوير الآبار من لوحة، للحصول على دورات وقت ولأي فوف، للحفاظ تلقائيا التركيز خلال القياسات وللسيطرة على عجلات الإثارة وتصفية الانبعاثات والمغير مزدوج اللون للتصوير متعدد الألوان الآلي. ومن الممكن أيضا لتشغيل "PRESCAN" الحصول على كثافة مضان من أجل تحديد تلقائيا وتسجيل مواقف FOVs مناسبة لاكتساب فليم لاحقة وفقا لمعايير، على سبيل المثال، على أساس كثافة. يمكن حفظ البيانات HCA فليم على شكل سلسلةمن ملفات TIFF، على شكل سلسلة من الملفات OME-TIFF (أي واحد في مجال الرؤية) أو كملف OME-TIFF واحد يشمل جميع البيانات من لوحة multiwell. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات وصفا مفصلا لبرنامج μManager على ويكي openFLIM-HCA 33.

برنامج تحليل البيانات، FLIMfit 31، عميل مفتوح المصدر استنادا MATLAB لصورة ميرو منصة إدارة البيانات 32، غير قادرة على قراءة البيانات فليم من خادم ميرو أو من قرص كمبيوتر، كما هو مبين في الشكل (4). وقد تم تصميمه لتحليل البيانات من TCSPC أو أدوات FLIM بوابات الوقت واسعة المجال، ويقدم العديد من القدرات لتناسب البيانات من openFLIM-HCA بما في ذلك تركيب لmonoexponential ملامح الاضمحلال، وإلى مضاعفة ملامح الاضمحلال تعقيد الأسي والعليا، بما في ذلك نماذج مثل لمحات مضان تسوس-حل الاستقطاب. ويمكن أيضا أن تأخذ في الاعتبار الإشارات خلفية ثابتة ومتغيرة مع الزمن، ويمكن أن التهاب المسالك البوليةليز لقياس المكانية والزمانية وظيفة استجابة أداة (IRF) أو يمكن أن يصلح باستخدام IRF المثالية التي يمكن أن تكون على أساس بكسل الحكمة بمبلغ محدد من قياس IRF تجريبي كامل الوقت تحول. وهناك فرق الوقت العالمي (ر 0) بين IRF وعينة الفلورسنت يمكن تحديد من قياس مستوى مضان. ويمكن أيضا أن تؤخذ الاختلافات المكانية في الإشارات الخلفية وIRF بعين الاعتبار. FLIMfit غير قادرة على احتواء البيانات فليم على أساس بكسل الحكمة أو باستخدام "binning العالمي" أو "العالمية المناسب" لتسهيل تركيب البيانات FLIM مع متواضعة (مئات) الفوتون الأرقام لنماذج تسوس المعقدة.

ينطوي binning العالمي تجميع جميع الفوتونات الكشف عن خلية داخل العائد على الاستثمار المعرفة في كل نقطة زمنية لتوفير أعداد الفوتون كافية لتمكين المناسب لنماذج تسوس المعقدة. العائد على الاستثمار يمكن أن يكون الحقل بأكمله من عرض (فوف)، يمكن أن يكون يدويا دefined من قبل المستخدم، أو يمكن تحديده باستخدام أدوات تقطيع الصورة. يمكن أيضا تعريف العائد على الاستثمار باستخدام أقنعة المستوردة إلى FLIMfit عن غيره من برامج تقطيع الصورة. لتطبيقات الحنق، فمن الشائع استخدام binning العالمي لتناسب إلى ضعف نموذج تسوس الأسي لتحديد مكونات مضان عمر المقابلة لFRETing وfluorophores المانحة غير FRETing التي يفترض أن تكون ثابتة مكانيا عبر العائد على الاستثمار ومن ثم إعادة تجهيز على أساس بكسل الحكمة مع هذه الوديان مكون حياة ثابتة من أجل الحصول على جزء السكان FRETing المانحة في كل بكسل.

تركيب العالمي يستلزم المناسب في وقت واحد مكونات الحياة وكسور السكان FRETing المانحة بكسل الحكمة عبر FOV- كليا أو عبر مجموعة من البيانات فليم التي يمكن أن تشكل FOVs متعددة، على سبيل المثال، من تجربة لوحة multiwell أو سلسلة زمنية من الصور مضان مدى الحياة. تركيب عالمي قادر على استغلال variati المكانيةعلى الكسور السكان عبر الصورة التي فقدت في نهج binning العالمي لتوفير قيود أقوى على تقدير عمر مكون – والنتائج وبالتالي أكثر موثوقية – وإن كان ذلك على حساب أكبر بكثير من حساب 35. FLIMfit يمكن تحليل بسرعة multiwell قواعد البيانات لوحة FLIM مع تركيب العالمي على محطات عمل الكمبيوتر التقليدية، على سبيل المثال، مجموعة multiwell بوابات وقت البيانات FLIM، استحوذت مع خمس بوابات الوقت لكل من 394 فوف يتألف كل منها من 672 × 512 بكسل، والتي تتطلب 32 ثانية فقط و 2 غيغابايت من الذاكرة لتتناسب مع لضعف نموذج تسوس الأسي 31. وقد تحقق ذلك من خلال الاستفادة من الخطية انفصال أقل الخوارزمية المناسب مربع تنفيذها باستخدام الخوارزميات المتوازية مؤشرات لتمكين التحجيم فعال على المعالجات متعددة النوى ولقد تم تطوير ورمز FLIMfit لتقليل استخدام الذاكرة. ويبين الشكل 5 لقطة من واجهة المستخدم الرسومية من FLIMfitومزيد من التفاصيل يمكن الاطلاع على صفحة ويب معينة في إشارة 36. مزيد من المعلومات عن تركيب العالمي وbinning العالمي يمكن العثور عليها في المرجع 31.

بروتوكول التالية لHCA FLIM استخدام لدينا أجهزة openFLIM-HCA والبرمجيات يمكن تكييفها لمجموعة واسعة من التجارب التصوير الخلية مع قراءات FLIM. بشكل عام، يجب تصميم التجارب لتشمل الآبار تكرار الضوابط البيولوجية الإيجابية والسلبية بالإضافة إلى الظروف التي تجري دراستها لوحة multiwell الحنق. هنا، نحن تصف تنفيذ محددة لأداء FLIM مقطوع بصريا (انظر الشكل 3) خلايا كوس التعبير عن الحنق يبني تتكون من البروتين الفلوري mTurquoise والزهرة البروتين الفلوري انضم اليهم رابط الببتيد قصيرة. هنا mTq32V، mTq17V وmTq5V الحنق بنيات (التي نوقشت في القسم ممثل النتائج) توفير الكفاءات الحنق عالية منخفضة ومتوسطة وجنبا إلى جنب مع غير FRETing mTq5A بناء.يتم سرد هذه التركيبات وغيرها من المواد اللازمة لمتابعة هذا البروتوكول في قائمة المواد.

Protocol

1. إعداد Multiwell لوحة صفيف يعد حل من 75 ميكرومتر الكومارين 6 في الإيثانول (τ ~ 2.43 م) لقياس مرجعية لتمكين تحديد ر 0. البذور 150،000 خلايا كوس إلى أربع آبار لوحة 6 جيدا والسماح لإرفاق بين عشية وضحاها في مستنبت (انظر قائمة المواد). Transfect بئر واحد لكل منها mTq5A، mTq5V، mTq17V وmTq32V باستخدام كاشف ترنسفكأيشن التجاري وفقا لتعليمات الشركة الصانعة والثقافة لمدة 24 ساعة. فصل الخلايا باستخدام حل التربسين / EDTA التجاري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ماصة 5000 كوس خلايا معلقة في هانك في محلول الملح المتوازن (HBSS) معربا عن mTq5A في كل من الآبار A1-G3 من 96 لوحة multiwell # 1.5 سمك القاع الزجاجي الذي سبق أن تعامل مع بولي-L-ليسين. كرر mTq5V معربا عن الخلايا في الآبار A4-G6، mTq17V في الآبار A5-G9 وmTq32V في الآبار A10-G12. </li> ترك جيدا H1 فارغة (لتقديم قياس أي خلفية ثابتة من لوحة multiwell). ماصة 200 ميكرولتر من HBSS فقط إلى H2 جيدا (لتقديم قياس أي إشارة الخلفية من مستنبت الخلية). ماصة 5000 خلايا غير transfected في HBSS إلى H3 جيدا (لتوفير قياس أي إشارة الخلفية من تألق ذاتي الخلوية). ماصة 200 ميكرولتر من 75 ميكرومتر الكومارين محلول الصبغة إلى جانب H4 (لتقديم شيك على أي تباين ر 0 خلال اقتناء لوحة multiwell، على سبيل المثال، نتيجة للتغيرات في درجة حرارة الغرفة أو لتقلبات في الليزر أو توقيت الدوائر. 2. openFLIM-HCA الحصول على البيانات ملاحظة: معلومات مفصلة يمكن الاطلاع على ويكي openFLIM-HCA 33. بداية μManager والمساعد OpenFLIM-HCA حدد ملف معايرة لتركيبة معينة من حدة تأخير مولد ومعدل تكرار الليزر تحت عنوان "فليم التحكم: تأخير ملف مربع المعايرة: معايرة الملفات". تعيين المجلد حيث سيتم حفظ البيانات في إطار "ملف: تعيين مجلد قاعدة". تحقق من مسار الإثارة شعاع لضمان اقتران في الألياف البصرية تسليم غير مستقر، وأن كفاءة اقتران تكبير عن طريق قياس القدرة المرسلة من خلال الألياف تسليم باستخدام السلطة متر. تقلبات أقل من 5٪ مقبولة. تأكد من أن الحكومة العراقية مما اثار مستقرة عن طريق عرض إشارة مراقبة الانتاج من الحكومة العراقية على الذبذبات الناجمة عن الحكومة العراقية إدخال إشارة الزناد. تحقق من التصوير من الفوسفور الحكومة الإسرائيلية على استشعار CCD من خلال تغطية ضوئي من الحكومة العراقية، ووضع مكاسبه إلى 750 V والتركيز واحدة من العدسات التتابع مثل أن صور الأحداث فوتون واحد متفرق (بسبب ضوء خلفية تسرب على الرغم من أن غطاء الحكومة الإسرائيلية ) المسجلة على اتفاقية مكافحة التصحر حادة قدر الإمكان. تأكد من أن عينةمجال الرؤية مضاءة بشكل موحد عن طريق التصوير عينة الفلورسنت موحدة، مثل قطرة من محلول الصبغة إشارة على ساترة، وذلك باستخدام قوة الإثارة منخفضة بما فيه الكفاية (<1 مللي واط) للتأكد من أن الحكومة العراقية لا المشبعة. حدد ملف تعريف لوحة المناسب، أي حدد الخيار لوحات 96-جيدا ( "ملف: خصائص تحميل لوحة"). باستخدام واجهة المستخدم الرسومية μManager، وضمان عدم وجود مزدوج اللون مكعب شعاع التقسيم في إطار المجهر عن طريق تحديد موقف فارغ. يدويا اختيار عرض بوابة 4 نانو ثانية في الحكومة العراقية للتجربة برمتها. الحصول على بيانات الصورة IRF: باستخدام واجهة المستخدم الرسومية μManager، وضمان عدم وجود الهدف المجهر في مسار الشعاع عن طريق تحديد موقف فارغ. يدويا وضع كتلة بأكسيد شعاع الأسود فوق برج موضوعية لمنع أي هروب ضوء الليزر وزاوية للحد من أي انعكاس مرة أخرى في إطار المجهر. <لى> استخدام μManager واجهة المستخدم الرسومية، تعيين المرشحات في CSUX (الإثارة، مزدوج اللون، الانبعاثات) على ان يكون جزء من ضوء الإثارة متناثرة من القرص نيبكو الغزل يمكن تصويرها ولكن ضمان كثافة ليست كافية لتشبع النظام للحصول على 200 مللي CCD الوقت التكامل. هذا هو لتجنب تعريض ضوئي الحكومة الإسرائيلية إلى الكثير من الضوء، والتي يمكن أن تلحق الضرر ضوئي. استخدام وظيفة بحث maxpoint على مجموعة كاملة من التأخير من قبل مربع تأخير سريع للبرمجة تغطيتها. تحقق المخطط الإخراج المعروضة ومن ثم ضبط اليدوي مربع بالطبع تأخير بواسطة الضغط على زر الأمام بحيث الشخصي IRF الكامل هو ضمن نطاق المسح الضوئي للمربع تأخير سريع. ضبط المعلمات اقتناء (الكثافة المحايدة، زمن التعرض، وتراكم الإطار) حتى لا تشبع اتفاقية مكافحة التصحر في ألمع الوقت بوابة والوقت التكامل الفعال هو> 200 مللي ثانية. دقت مجموعة خطوات تأخير من 25 ملاحظة على تأخير الكامله ( "السيطرة فليم: سريع مربع التأخير: تعبئة التأخير"). الحصول على صورة IRF عن طريق الضغط على "صورة التقط FLIM". الحصول على صورة الخلفية من خلال منع الليزر ( "السيطرة مسار الضوء: الكثافة المحايدة: منعت")، مما يقلل من عدد من التأخير ( "السيطرة فليم: مربع تأخير السريع: إعداد تأخير الحالي (ملاحظة)")، وترك جميع الخصائص الأخرى دون تغيير و اضغط على "التقط صورة فليم". الحصول على البيانات صبغ إشارة: حدد H4 جيدا باستخدام μManager واجهة المستخدم الرسومية ( "السيطرة XYZ: الذهاب إلى جيد: H4"). باستخدام واجهة المستخدم الرسومية μManager، حدد المرشحات (الإثارة 434/17 نانومتر، مزدوج اللون، انبعاث 482/25 نانومتر) لتصوير mTqFP. استخدام وظيفة بحث maxpoint على مجموعة كاملة من مربع تأخير سريع ومن ثم ضبط مربع تأخير الخشنة حتى الشخصية الاضمحلال الكامل هو ضمن نطاق تأخير مربع تأخير سريع. تعيين التأخيرإلى درجة الحد الأقصى لكثافة عن طريق تغيير "السيطرة FLIM: مربع تأخير السريع: إعداد تأخير الحالي (ملاحظة)". ضبط المعلمات اقتناء (الكثافة المحايدة، زمن التعرض) بحيث لا يتم المشبعة اتفاقية مكافحة التصحر. تعيين الخطوات تأخير من 25 ملاحظة على نطاق تأخير الكامل ( "السيطرة فليم: سريع مربع التأخير: تعبئة التأخير). الحصول على البيانات صبغ إشارة عن طريق الضغط على "صورة التقط FLIM". الحصول على خلفية الثانية صورة كاميرا CCD من خلال منع الليزر الإثارة (انظر 2.11.7) الحصول على البيانات فليم من العينة لوحة multiwell باستخدام برنامج الحصول على μManager: مجموعة التي ينبغي تصوير الآبار وعدد من فوف التي سيتم الحصول عليها لكل بئر ( "إعداد HCA التسلسل الاستحواذ: مواقف XYZ"). يدويا تحديد فوف نموذج يحتوي على عينة ليمكن تصوير. استخدام هذا فوف لتحديد أفضل مرشح الكثافة المحايدة، عرض البوابة في الحكومة العراقية والوقت التكامل الكاميرا وذلك لتصل إلى 75٪ من مجموعة ديناميكية من كاميرا CCD. تعيين ضبط تلقائي للصورة ( "السيطرة XYZ: ضبط تلقائي للصورة"): اضغط على "تركيز الرقابة عودة فقط"، ومن ثم التركيز يدويا على الخلايا أو بنية الفائدة. ضبط "ضبط تلقائي للصورة نطاق البحث" إلى 2000 ميكرون ثم اضغط على "دخول". اضغط على "AF الآن" لبدء إجراء ضبط تلقائي للصورة. وسوف تظهر قيمة تعويض يصل في الميدان "FocusOffset (ضبط تلقائي للصورة)". أدخل قيمة تعويض تم الحصول عليها في 2.13.3 إلى "AF تعويض" وكرر هذا الإجراء مرتين ضبط تلقائي للصورة ( "AF الآن") للتأكد من أن قيمة الإزاحة الآن الصفر، مشيرا إلى الأداء السليم للنظام ضبط تلقائي للصورة. استخدام وظيفة "AutoGate" في برنامج الحصول على OpenFLIM-HCA لاختيار العينات لوغاريتمي من النقاط تأخير. بدلا من ذلك، هذه يمكن تحديدها يدويا، انظر الرجوعسينعقد 36 لمزيد من التفاصيل. ضبط "تجميع إطارات" إلى قيمة العوائد المرجوة إجمالي وقت الحصول على البيانات. زيادة عدد الإطارات المتراكمة يزيد إشارة إلى نسبة الضوضاء من البيانات FLIM على حساب زيادة أيضا إجمالي وقت الحصول على البيانات FLIM. تشغيل اكتساب FLIM من لوحة multiwell عن طريق الضغط على زر "ابدأ تسلسل HCA". الحصول على مزيد من صورة الكاميرا الخلفية لاتفاقية مكافحة التصحر من خلال منع الليزر الإثارة (انظر 2.11.7) مع إعدادات اكتساب متطابقة كما تستخدم لجمع البيانات FLIM. 3. تحليل البيانات openFLIM-HCA عن طريق FLIMfit تأكد من أن الملفات الإضافية اللازمة لتحليل البيانات فليم موجودة (أي IRF وقياس صبغ المرجعية). تحميل البيانات من البئر فارغ (H1)، والمتوسط ​​تحتوي كذلك ثقافة (H2) والتي تحتوي أيضا الخلايا غير المسماة في مستنبت (H3) إلى FLIMfit( "ملف: البيانات FLIM تحميل") للتحقق ما إذا كانت هناك أية مساهمات خلفية أكبر من 1٪ من إشارة من الخلايا معربا عن "المانحين فقط"، أي في آبار A1-G3. إعداد خلفية ملف زمنية متفاوتة (TVB) عن طريق تحميل بشكل جيد مع الثقافة المتوسطة في FLIMfit ( "ملف: البيانات FLIM تحميل"). تحميل البيانات كاميرا خلفية المكتسبة في القسم 2.14 ( "الخلفية: تحميل خلفية") واستخدام "أدوات: إنشاء TVB كثافة خريطة" خيار FLIMfit لتوليد TVB. أنظر المرجع 31 لمزيد من التفاصيل على TVB. إعداد متفاوتة مكانيا IRF التحول خريطة طريق تحميل البيانات IRF المكتسبة في القسم 2.11 وطرح الخلفية كاميرا CCD المكتسبة في القسم 2.11.7. استخدام الخيار FLIMfit "أدوات: إنشاء IRF التحول خريطة" لحساب متفاوتة مكانيا IRF التحول خريطة. أنظر المرجع [31] لمزيد من التفاصيل على التحول خريطة IRF. تناسب monoexponenالمكاني تسوس إلى البيانات صبغ إشارة المكتسبة في القسم 2.12. تحميل صبغ إشارة وخارطة IRF متفاوتة مكانيا المحسوبة في القسم 3.4، ووضع معايير مناسبة ( "مدى الحياة: رقم إكسب:" 1) مع ر 0 مجموعة كمعلمة المجهزة ( "العمر: FIT IRF التحول: جاهزة"). ثم يقال قيمة ر 0 تم الحصول عليها في الجدول المبين في علامة التبويب "معلمات". تحليل البيانات فليم عن طريق تحميل البيانات FLIM التجريبية المكتسبة في القسم 2.13، وIRF خريطة متفاوتة مكانيا المحسوبة في القسم 3.4، الخلفية كاميرا المكتسبة في القسم 2.14، الملف TVB أعدت في القسم 3.3 واكتب في قيمة سالبة ر 0 تم الحصول عليها في القسم 3.5 ( "IRF: IRF التحول: ر 0"). ثم احتواء البيانات التجريبية للنموذج تسوس المطلوب باستخدام FLIMfit 36 وفقا لمتطلبات التجربة.

Representative Results

لتوضيح قدرات الأجهزة openFLIM-HCA، ​​نقدم ثلاثة تطبيقات الحنق نموذج. اولى اهتمامات الحنق التركيبات التي يتم تكييفها من يبني نموذج الحنق التي وضعتها المختبر ستيفن فوغل في 38. وهي تتكون من سلسلة من بنيات فلوري التعبير عنه وراثيا التي تم ربط المانحة ببروتين (mTurquoise) إلى fluorophore متقبل (فينوس) من خلال أطوال تسيطر قصيرة من الأحماض 5 و 17 و 32 الأمينية (mTq5V، mTq17V، mTq32V). أطوال رابط مختلفة بين الجهات المانحة ومتقبل fluorophores تؤدي إلى كفاءات الحنق مختلفة، وأعمار المانحة بالتالي مختلفة. لتوفير سيطرة سلبية، يتم استبدال فينوس على المدى القصير 5 الأحماض الأمينية رابط قبل تشييد العنبر – طفرة غير الفلورسنت من YFP (mTq5A) التي لا يمكن أن تكون بمثابة متقبل الحنق 38. استبدلنا فندق Cerulean في ناقلات pCXV وpC5A الأصلية تقييد هضم vectأملاح الإماهة الفموية مع NheI وBglII الانزيمات وligating شظايا mTurquoise هضمها باستخدام نفس الانزيمات من ناقلات pmTurquoise-N1. وقد معدلة المنطقة رابط من هذا الاستبدال. ويبين الشكل 6 لFLIM قدوة الحنق فحص باستخدام هذا النظام النموذجي أعرب في خلايا كوس، التي يتم حشدها لوحة multiwell مع 3 أعمدة في كل من خلايا transfected مع سيطرة سلبية (الأعمدة 1-3)، رابط حمض أميني 5 الحنق بناء (الأعمدة 4-6)، رابط حمض أميني 17 الحنق بناء (الأعمدة 7-9) ورابط حمض أميني 32 الحنق بناء (الأعمدة 10-12). الصف H يحتوي على الآبار لتقدير TVB. (أ) ويبين الشكل 6 أمثلة المكتسبة تلقائيا مضان صور عمر حقول نموذجية نظر في كل بئر. ومن الواضح أن سيطرة سلبية (الأعمدة 1-3) تمثل أطول عمر وعمر المانحة هو أدنى مستوى للالحنق بناء مع أقصر ليون رابطGTH (الأعمدة 4-6). (ب) يبين الشكل (6) كيف بلغ متوسط متوسط عمر أكثر من كل FOVs في كل يختلف بشكل جيد عبر لوحة multiwell. أرقام 6 (ج) و (د) تظهر مضان المانحة خرائط عمر نموذج الكثافة المدمجة لفوف من mTq5A وmTq17V على التوالي. الرقم 6 (ه) يظهر مضان المانحة ملف كثافة تسوس بلغ متوسط على كل الخلايا تصويرها بشكل جيد A1، جنبا إلى جنب مع صالح إلى نموذج تسوس monoexponential وIRF (الذي يهيمن عليه عرض بوابة الحكومة الإسرائيلية). الرقم 6 (و) تقدم متوسط عمر مضان لكل عمود لوحة multiwell تم الحصول عليها من نوبة monoexponential بكسل الحكمة. ويمكن الاطلاع على جدول متوسط العمر، والانحراف المعياري (STD) في الجدول 1 أدناه. استغرق الحصول على البيانات للصور هو مبين في الشكل (6) ما يقرب من 160 دقيقة للحصول على. استغرق التحليل 92 ق على جهاز كمبيوتر 2.6 غيغاهرتز مع 10 النوى و 64 Gب من ذاكرة الوصول العشوائي. يوضح فحص قدوة الثاني تطبيق FLIM الحنق أن يتلو oligomerization من HIV-1 الكمامة أثناء تجميع HIV-1 virions كوسيلة لاختبار مثبطات هذه العملية 25،42. معربا عن HIV-1 الكمامة في الخلايا المضيفة المناسبة توفر نظام نموذجي لهذه المرحلة من مراحل دورة حياة HIV-1 لأنه يؤدي إلى تكوين جزيئات فيروسية مثل (VLPs) التي تشبه إلى غير ناضجة HIV-1 virions. لهذا الاختبار، عبرنا عن HIV-1 الكمامة البروتين تنصهر مع CFP في خلايا هيلا وقارن عمل مثبطات مختلفة عن طريق تأثيرها على إشارة الحنق التي نتجت عن oligomerization الكمامة. وترد تفاصيل مثبطات المستخدمة في إشارة 42. ووصف تفاصيل إعداد العينات والقياسات التجريبية شامل في اشارة 25، حيث أثبتنا أننا يمكن أن تستخدم FLIM تلا بوعشر heteroFRET بين تجميع البروتينات الكمامة المسمى عشوائيا مع CFP ومع YFP، وأيضا homoFRET في الخلايا معربا عن الكمامة الوحيد المسمى مع CFP. على الرغم من أن homoFRET لا يقدم عادة ما يكون التغيير في حياة المانحة، فإنه لحالة خاصة من CFP حيث يوجد fluorophore في أيزومرين مع مختلف أعمار مضان متوسط 40،41. وCFP وطي الحنق قراءات لديها مزايا إعداد نموذج مبسط مقارنة CFP / YFP مغاير الحنق وأكثر كفاءة الطيفية، والتي قد تكون مهمة للقراءات الحنق المضاعفة. تطبيق عملنا السابق FLIM الحنق لفحص وoligomerization الكمامة في وجود N-myristoyltransferase (NMT) المانع 42. هذا المانع يعطل الإنزيمات الذاتية المسؤولة عن إضافة حمض الميريستيك إلى الكمامة، والتي تمكن البروتينات الكمامة لربط لغشاء البلازما وهو شرط أساسي 43 في تشكيل virions فيروس نقص المناعة البشرية أوVLPs. أظهرنا أن كلا heteroFRET وhomoFRET قراءات يمكن تحقيق Z 'من> 0.6 في الدراسات الاستجابة للجرعة مع مثبط NMT. Z 'هو معلمة المستخدمة في صناعة المستحضرات الصيدلانية للإشارة إلى الجودة لفحص ويمثل الاختلاف في القيم الوسطية من الضوابط الإيجابية والسلبية وينتشر النسبية لتوليد قياس قيمة واحدة من نوعية الفحص – مع Z'> 0.5 يجري النظر "ممتاز" لفحص المستحضرات الصيدلانية 44. نلاحظ تحقق هذا الأداء الممتاز مع العينات التي كان التغيير في حياة المانحة نفسه من أجل من 300 PS – مما يدل على قوة الإحصائية لتحليل البيانات FLIM لأعداد كبيرة من الخلايا، والتي تمكن قراءات مفيدة لأن تتحقق باستخدام أصغر بكثير التغييرات في عمر مضان مما هو ممكن مع الأرقام نموذجية من الخلايا تصويرها في التجارب المجهري اليدوية. هنا، نقدم لوحة FLIM multiwell الحنق مجموعة البيانات مقارنة 4 مركبات مثبطات لفيروس نقص المناعة البشرية الكمامة oligomerization (المعين ICL13، ICL14، ICL15 وICL16). لهذه التجربة، ونحن الاستفادة من قراءات homoFRET مع خلايا هيلا transfected عابر مع البلازميد الكمامة-CFP. طبقت ما مجموعه تسعة جرعات مختلفة من كل المانع بعد بروتوكول قياسي المبينة في المرجع 32، والسماح اثنين من تكرار الآبار في حالة. كما تحكم إيجابية، العمود 1 يعرض الخلايا معربا عن MYR-الكمامة، والبروتين الكمامة تحور تفتقر شاردة حمض Myristic التي لا يمكن أن تشكل VLPs وحتى يحاكي تثبيط الكلي. وقدم الشاهد السلبي من الجرعات الخلايا معربا عن الكمامة-CFP فقط مع مجرد وسيلة تستخدم لتوصيل مثبطات في الأعمدة الأخرى (العمود 11). تم الحصول على ما مجموعه ثمانية فوف لكل بئر. تم تركيب البيانات مع نموذج الاضمحلال الأسي واحد على أساس بكسل حسب بكسل وبلات مضان مدى الحياةويرد ه خريطة توضح متوسط عمر لكل بئر (على كل بكسل فوق عتبة كثافة عبر الحقول ثمانية نظر) في شكل 7 (أ). الرقم 7 (ب) يظهر المؤامرة المقابلة من عمر مضان كدالة للتركيز مثبط. ثلاثة من مثبطات تظهر تأثير كابح (ICL13، ICL15 وICL16) عندما حضنت مع الخلايا معربا عن الكمامة-CFP. واحد المانع (ICL14) لا يظهر أي تأثير في أي جرعة اختبار. كان Z 'المحسوبة لهذه اللوحة 0.51. وتظهر القيم التي تم الحصول عليها من الضوابط الإيجابية والسلبية على الشكل 7 (ب) على أنه نقطة في الأسود في 100 ميكرومتر و 0.1 نانومتر. منحنيات الاستجابة للجرعة لICL13، ICL15 وICL16 هو مبين في الشكل 7 (ب) ثم تم تركيبها على 4 المعلمة اللوجستي نموذج الانحدار غير الخطية مع معامل هيل الثابتة إلى 1 45 مع الحد الأقصى والحد الأدنى من عمر ثابت للالقيم التي تم الحصول عليها من الإيجابي (العمود 1) والسلبية (العمود 11) تسيطر على التوالي. كانت IC 50 القيم التي يتم إرجاعها للمنحنيات ثلاثة ثم: 38 نانومتر و 24 نانومتر و 116 نانومتر للICL13، ICL15 وICL16 على التوالي. وعلى سبيل المقارنة مع IC 50 القيم التي تم الحصول عليها من خلال FLIM الخلايا الحنق القياسات، ونحن مصممون IC 50 لتثبيط النشاط الأنزيمي من NMT1 البشري المؤتلف في تقريرنا السابق الكيمياء الحيوية انزيم فحص 42. المركبات الثلاثة وجدت لتكون نشطة من قبل FLIM الحنق هي أيضا الأكثر نشاطا في هذا الاختبار (IC 50 قيم 17 نانومتر و 51 نانومتر و 39 نانومتر لICL13، ICL15 وICL16، على التوالي)، مع ICL14، التي لم تبد أي استجابة كبيرة في مقايسة FLIM الحنق، ويجري كاليفورنيا. 100 أضعاف أقل نشاطا ضد NMT1 (IC 50 من 1700 نانومتر). لالمركبات النشطة، والقيم IC 50 تم الحصول عليها من خلال هذه الطرائق فحص مستقلة متشابهة بشكل ملحوظ، مع وجود اختلافات طفيفة تعزى على الأرجح إلى دifferences في امتصاص أو التمثيل الغذائي للمجمع في الخلايا. هذه دراسة صغيرة يسلط الضوء على قدرة HCA FLIM التمييز قوة من المركبات المختلفة التي تعمل على نفس الهدف من الفائدة. ونحن نعتقد أن هذا هو أول مظاهرة من الشاشة باستخدام FLIM الآلي في سياق المحتوى العالي لتوليد متعددة منحنيات الاستجابة للجرعة ويوضح إمكانية FLIM ليتم تطبيقها على الشاشة لو / أو تميز المركبات العلاجية المفيدة. في نموذج التجربة FLIM الحنق الثالثة تتعلق جهاز الاستشعار البيولوجي الحنق أعرب وراثيا لبروتين تبادل تفعيلها من خلال أحادي فسفات الأدينوزين الحلقي (المخيم (إيباك))، وهو الراب-1 جوانين عامل الصرف التي تربط خصيصا لالمخيم. هذا جهاز الاستشعار البيولوجي EPAC الحنق (إيباك-S H188) يستخدم mTurquoise2 بروتين فلوري (mTq2FP) كما fluorophore المانحة ويضم اثنين فينوس-FP لتنفيذ التعاونmposite متقبل 46. المخيم هو رسول الثاني في كل مكان، وتشارك في عدد كبير من العمليات داخل الخلايا في جميع أنحاء العديد من الكائنات الحية المختلفة. يتم تصنيعه من قبل محلقة محلقة من تحويل ATP في غشاء الخلية. هنا علينا أن نظهر قدرتنا على قراءة وقياس النشاط في خلايا HEK293T الحية بعد إضافة forskolin، وهو إنزيم منشط محلقة أن upregulates إنتاج الخلايا من المخيم، وبالتالي يزيد من تركيزه حشوية. هذا الاستشعار EPAC يخضع الحنق في (غير منضم) دولة المعطل، وزيادة في العمر المانحة مع تركيز المخيم كما يؤدي المخيم لافتتاح جهاز الاستشعار البيولوجي. الملف الشخصى تسوس أحادية الأسي من mTq2FP يجعل هذا جهاز الاستشعار البيولوجي أكثر ملاءمة للتحليل الكمي مدى الحياة من أجهزة الاستشعار على أساس CFP-45. ويبين الشكل 8 مثال على دوام مسجلة باستخدام الآلي لوحة multiwell FLIM المجهر حيث قمنا تآمر التغييرفي متوسط ​​العمر، والتغير في نسبة السكان FRETing المانحة مع مرور الوقت بعد إضافة 100 forskolin ميكرومتر. للبساطة، ونحن نفترض أن الإشارة الإجمالية يمكن وصف خليط من FRETing monoexponential والجهات المانحة غير FRETing وجزء السكان من جهاز الاستشعار البيولوجي EPAC الحنق تنشيط تم الحصول عليها عن طريق تركيب لمحة الاضمحلال الأسي المزدوج عبر سلسلة زمنية. للحصول على البيانات من مخيم (إيباك) خمسة التأخير البوابة، ويبلغ عرضه بوابة 4000 ملاحظة، وقد تم اختيار مع تأخير الوقت لتعيين 1300 ملاحظة، 4300 ملاحظة (ذروة الكثافة)، 4919 ملاحظة، 6656 ملاحظة، 8035 ملاحظة (1)، 0391 ملاحظة وملاحظة 16،000. كان الوقت التكامل الكاميرا لكل تأخير 250 مللي ثانية. في واحدة جيدا، حصلنا على فليم الوقت طبعا مع صور حصلت كل 10 ثانية أكثر من 10 دقيقة. أزيلت نقاط البيانات التي حصل عليها في بعض الأحيان 120 ق و 130 ق لأن إضافة forskolin تسبب في تحول صغير في موقف البؤري للعينة ولذلك(ه) من شدة مضان سجلت خلال الاستحواذ FLIM في هذه النقاط مرة. لتحليل البيانات وتحميل الصور إلى FLIMfit ومجزأة في كل خلية. تم تركيب البيانات مضان العمر لنموذج الاضمحلال الأسي المزدوج باستخدام IRF وثابت ر 0 قيمة تم الحصول عليها من صبغة المرجعية (75 ميكرومتر الكومارين 6). مضان المانحة يعني مدى الحياة بمعدل متوسط أعلى من جميع الخلايا في الشكل 8 (أ). الرقم 8 (ب) تبين التغير في نسبة السكان FRETing مع مرور الوقت تحسب عن طريق تركيب نفس البيانات فليم لنفس النموذج الاضمحلال المزدوج الأسي حيث β هو جزء المانحة FRETing. ونحن نفترض خليط من FRETing وإيليمي غير FRETingاليلة لنقطة زمنية سابقة لإضافة forskolin. للحصول على هذه الأعمار، تم تطبيق تناسب الأسي المزدوج إلى ثلاث نقاط لأول مرة يعطي عمر من τ 1 = 3964 ± 21 ملاحظة للمتبرع غير FRETing، وτ 2 = 3022 ± 27 ملاحظة على المتبرع FRETing. تم إصلاح هذه لتناسب لاحق من البيانات مجموعة كاملة للحصول على القيم β في كل نقطة زمنية. وباختصار، قدمنا ​​نموذجا النتائج HCA فليم لمدة ثلاثة نماذج تجريبية. كان أول لوحة جيدا 96 المحتشدة مع خلايا كوس التعبير عن الحنق يبني تضم الجهات المانحة mTqFP مرتبطة إما متقبل فينوس FP أو غير الفلورسنت العنبر بناء من قبل أطوال رابط الببتيد متفاوتة. التغيير في الحنق الكفاءة، وبالتالي مدى الحياة المانحة مع طول رابط واضح بشكل واضح وكان الانحراف المعياري للحياة يعني لكل بناء أقل من 36 فرع فلسطين. وأسا قدوة الثانيكان ذ "الشاشة" من أربعة مثبطات محتملة للmyristoylation من البروتين فيروس نقص المناعة البشرية الكمامة التي تم حسابها تثبيط٪ من التباين في متوسط ​​عمر مضان المانحة مع تركيز مثبط تقاس في خلايا هيلا التعبير عن بروتين الكمامة المسمى مع CFP. ويستند هذا قراءات في homoFRET، الذي لن يقدم عادة ما يكون التغيير في حياة المانحة ولكن لا لCFP لأن هذا موجود في أيزومرات متعددة مع عمر الفلورسنت مختلفة. هذا يمكن أن يكون مفيدا من حيث الكفاءة الطيفية، على سبيل المثال، لمضاعفة قراءات الحنق مختلفة 25. وكان فحص قدوة الثالث على دوام مراقبة خلايا HEK293T الحية معربا عن جهاز الاستشعار البيولوجي المخيم الحنق، EPAC. وهذا يدل على استجابة المتوقعة بعد العلاج مع forskolin وتطبيق FLIMfit استخدام مزدوج نموذج تسوس الأسي مع عدد من الفوتونات الكشف عن كونها تتناسب مع تصوير الخلايا الحية – كما بينا سابقا مع biosen يبرا الحنقسور لIP3 47. الشكل 1. رسم تخطيطي للواسعة المجال FLIM بوابات الوقت باستخدام بوابات مكثفا للصورة البصرية (الحكومة الإسرائيلية). الجانب الأيسر، ويظهر التخطيطي للنظام التجريبي. أعلى يمين، التخطيطي نبض الإثارة، والموقف من الصور بوابات الوقت وتناسب monoexponential إلى البيانات. أسفل اليمين، والرسوم المتحركة التي تبين الاضمحلال مضان من الكائنين هو مبين في النظام التجريبي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2. تخطيطي واسعة المجال openFLIM-HCA باستخدام بوابات مكثفا للصورة البصرية (الحكومة الإسرائيلية). انظر النص الرئيسي لوصف أكثر تفصيلا للمكونات النظام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3. تخطيطي مقطوع بصريا openFLIM-HCA باستخدام بوابات مكثفا للصورة البصرية (الحكومة الإسرائيلية) مع وحدة القرص الضوئي نيبكو. انظر النص الرئيسي لوصف أكثر تفصيلا من مكونات النظام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4. رسم تخطيطي للتدفق بيانات الصورة من برنامج اكتساب مدير لميرو الخادم أو قرص كمبيوتر وإلى FLIMfit للتحليل. يبدأ تدفق البيانات في أكبر ل ركن EFT حيث يتم الحصول على بيانات الصورة الخام في برنامج الحصول على ميكرون-مدير. البنود داخل مربع متقطع تمثل مراحل تحليل البيانات FLIM، في حين أن من هم خارج تتوافق مع الحصول على البيانات والتخزين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 5. لقطة من واجهة المستخدم FLIMfit. أعلى اليسار، قائمة الحقول النظر التي تم تحميلها حاليا والصورة كثافة مضان من الحقل المحدد حاليا للعرض. الجزء السفلي الأيسر، واختيار النموذج المناسب والظروف مناسبة. أعلى يمين، وتسوس مضان عن المنطقة الحالية من الفائدة (الدوائر الزرقاء)، يصلح لبيانات (خط أحمر)، IRF (أحمر متقطع الخط) مع مخلفات تناسب أدناه (الخط الأزرق).g5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 6. Multiwell لوحة FLIM نموذج الحنق يبني mTq5V، mTq17V، أعرب mTq32V في خلايا كوس. (أ) نموذج الصور مضان عمر فوف في كل بئر ليبني الحنق المختلفة التي أعرب عنها في خلايا كوس كما هو مبين في النص. (ب) خريطة حرارة متوسط أعمار مضان الزهرة بمعدل متوسط على جميع الخلايا في كل بئر. (ج) صورة شدة mTurquoise العنبر مضافين مع خريطة عمر (شريط نطاق 20 ميكرون). (د) صورة شدة mTurquoise فينوس (17 حمض أميني) مضافين مع خريطة عمر (شريط نطاق 20 ميكرون). (ه) لمحة قياس كثافة تسوس (الدوائر الزرقاء) من mTq5A بناء (المراقبة السلبية) متوسط مضان على كل الخلايا تصويرها بشكل جيد وهناك1، جنبا إلى جنب مع نوبة من البيانات إلى تسوس monoexponential (خط الصلبة الأزرق) وIRF (متقطع الخط البرتقالي). (و) رسم بياني لمتوسط عمر متوسط فوق كل عمود عبر لوحة multiwell، مع أشرطة الخطأ تبين الانحراف المعياري في عمر مضان بين الحقول نظر. يتم تمثيل ل(الإعلان) قيم الحياة باستخدام مقياس اللون كاذبة مع الحدود المشار إليها في picoseconds. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الرقم 7. نموذج multiwell الشاشة لوحة FLIM مثبطات الكمامة باستخدام خلايا هيلا معربا عن الكمامة-CFP. (أ) خريطة الحرارة من متوسط عمر مضان المانحة لكل بئر لوحة multiwell تناثرت مع العمود 1 عرض الخلايا transfected مع MYR-الكمامة-CFP باعتباره ايجابيات السيطرة الإلكترونية للكبت، العمود 11 عرض الخلايا transfected مع الكمامة-CFP عرضة للمركبة فقط، والساحات الملونة متقطع يدل على الآبار التي تم مداوي مع واحدة من مثبطات الأربعة المختلفة بتركيزات تتراوح من ارتفاع عمود الجرعة من 2 إلى انخفاض عمود جرعة 10 ويمثل مقياس اللون كاذبة عمر مضان متوسط ​​تتراوح بين 2200 ملاحظة إلى 3100 فرع فلسطين. (ب) المؤامرات عمر مضان لكل المانع مع أشرطة الخطأ تظهر الانحراف المعياري بين تكرار الآبار. النقاط باللون الأسود في 2 و -4 على المحور الأفقي هي النقاط الإيجابية والسلبية سيطرة الحصول على التوالي من الأعمدة 1 و 11 على التوالي. خطوط الصلبة تشير إلى وجود تناسب لبيانات منحنى الاستجابة للجرعة لمثبطات مختلفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. جوري 8 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 55119 / 55119fig8.jpg "/> الرقم 8. استخدام نموذج من FLIM لقراءة جهاز الاستشعار البيولوجي EPAC الحنق في قياس الوقت الفاصل بين استخدام الخلايا HEK293T. تغيير في الفقرة (أ) يعني عمر مضان و (ب) جزء من FRETing المانحة بوصفها وظيفة من الزمن بعد إضافة forskolin يدل على ذلك شريط أخضر. تظهر أشرطة الخطأ والخطأ المعياري لكل خلية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. في حسنا الأمراض المنقولة جنسيا العائد الاقتصادي في حسنا الأمراض المنقولة جنسيا العائد الاقتصادي mT5A 4008 32 12 mT17V 3004 26 10 mT5V 2717 35 13 mT32V 3133 30 11 الجدول 1. متوسط العمر، والانحراف المعياري (STD) من بنيات الحنق.

Discussion

وصفناها لوحة المجهر multiwell الآلية المصممة لHCA باستخدام FLIM بوابات الزمن. يتم التحكم هذا الصك باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر مكتوب في μManager مع خيار حفظ البيانات إلى ملقم ميرو وتحليل البيانات FLIM التي يجري الاضطلاع بها باستخدام FLIMfit 36، وهو برنامج مفتوح المصدر مكتوب في ماتلاب ومتاحة كعميل ميرو 32 صك μManager برنامج حاسوبي لمراقبة، openFLIM-HCA، على شبكة الإنترنت 33 مع قائمة من مكونات النظام 48 لتمكين الباحثين الأكاديميين لبناء أدوات FLIM HCA الخاصة بهم.

من أجل الحصول على البيانات FLIM قوية، فمن الضروري لتحسين الحكومة العراقية وCCD إعدادات اقتناء وتأخذ في الاعتبار أية تغييرات في ر 0. كما هو موضح في 3.8.2، يجب تعيين الحكومة العراقية وضع الكسب وكاميرا CCD الوقت التكامل للوصول ~ 75٪ من النطاق الديناميكي لاتفاقية مكافحة التصحر. Uالغناء ارتفاع الفولتية الحكومة الإسرائيلية ومتعددة تراكمات إطار اتفاقية مكافحة التصحر في كل فترة زمنية بوابة يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء 49 ولكن هذا يزيد من اكتساب الوقت FLIM الإجمالي (منذ يتم الحصول على عدد أقل من الفوتونات مضان في الإطار قبل أن يشبع كاميرا CCD وبالتالي فإن عدد تراكمات إطار ينبغي زيادة) وحتى هذه المفاضلة ينبغي أن يتقرر لكل تجربة. معايرة مولد تأخير يعتمد على معدل تكرار الليزر ولذلك فمن الضروري ضمان أن يتم تحميل ملف معايرة الصحيح لمعدل تكرار استخدامها في اقتناء البرمجيات. إجراء معايرة مربع تأخير يمكن العثور على ويكي openFLIM-HCA 33.

إذا كان تألق ذاتي الخلوية منخفضة بالمقارنة مع إشارة مضان، ونحن نستخدم إشارة من يحتوي أيضا مستنبت فقط لتوفير الخلفية زمنية متفاوتة (TVB). للحد من مضان الخلفية من خلية ثقافة المتوسط، نتجنبوسائل الإعلام التي تحتوي على الفينول الأحمر. إذا كان تألق ذاتي الخلوية كبير، ثم TVB يمكن الحصول عليها من قياسات الخلايا غير المسماة. ومع ذلك، في هذه الرعاية الحالة يجب أن تؤخذ، وهذا يفترض أن خلفية تألق ذاتي هو نفسه لكل بكسل في الصورة. وهذا الافتراض لا يكون صحيحا إذا تألق ذاتي يختلف اختلافا كبيرا عبر خلية أو إذا كان شعاع الإثارة أو حساسية الكشف ليست موحدة على مجال الرؤية.

الحصول على صورة IRF باستخدام المنتشرة نبضات ضوء الإثارة يوفر الشخصي IRF الزمني الذي convolved مع نموذج البيانات في عملية تركيب ويوفر أيضا خريطة من التباين المكاني للIRF عبر مجال الرؤية. وهذه القوة يمكن قياسها عن طريق التصوير عينة نثر مثل تعليق الغروية على الرغم من، في وثيقة لدينا، وذلك باستخدام ضوء الإثارة متناثرة من القرص نيبكو يوفر قياس أنظف من الحرية الدينية الدولية. تحديد دقيق لتوقيت سو مؤسسة البحوث الدولية أمر مهم لأن الأخطاء في تأخير الوقت بين الإثارة والوقت النابضة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على عملية تركيب، لا سيما عندما المناسب لنماذج تسوس الأسي المعقدة. حصلت على IRF باستخدام ليست بالضبط ما هو مطلوب لعملية تركيب ليتم تسجيله في الطول الموجي الإثارة وليس في الطول الموجي الانبعاثات مضان ضوء الإثارة متناثرة، والتي يمكن أن تؤثر على توقيته، على الرغم من التباين المكاني للIRF يجب أن تكون هي نفسها في كل الأطوال الموجية. بالإضافة إلى ذلك، IRF المتناثرة قد تحولت على الصعيد العالمي في وقت قريب إلى IRF صحيح بسبب طول مسار بصري مختلفة من الجسم نثر، كما هو الحال بالنسبة للIRF تم الحصول عليها من القرص نيبكو في FLIM مقطوع بصريا. ويحسب هذا التصحيح، ر 0، وهو التحول الزمني العالمي المطلوبة التي يجب تطبيقها على الحصول عليها منتشرة IRF ضوء الإثارة، من البيانات صبغ إشارة monoexponential كما هو مبين في Protocرأ خطوة 4.4. الأصباغ التالية يمكن استخدامها لموجات الإثارة مختلفة: 75 ميكرومتر الكومارين 153 حل في الميثانول (τ ~ 4.3 م 50) يمكن أن تستخدم في الإثارة في نطاق 295-442 نانومتر. 75 ميكرومتر الكومارين 6 حل في الإيثانول (τ ~ 2.43 م 37) يمكن أن تستخدم في الإثارة في نطاق 430-500 نانومتر. و75 ميكرومتر حل Rhodamine باء في الماء (τ ~ 1.7 م 37) يمكن أن تستخدم في الإثارة في نطاق 488-575 نانومتر. ونلاحظ أنه على الرغم من أنه من الممكن في FLIMfit استخدام IRF مختلفة لكل بكسل من النظام، وعادة ما هو معقول لجعل افتراض أن IRF متفاوتة مكانيا لديه نفس الشخصية الزمني لكل بكسل في الصورة ولكن يقدم مجموعة من مكانيا متفاوتة إزاحة الزمنية النسبية للر العالمي 0. وصفنا هذا النحو خريطة التحول IRF، والتي يتم تحديدها من IRF الضوء المتناثرة. معا، يتم استخدام الشخصي IRF، ر 0 وخريطة التحول IRF أونتأكد من أن كل بكسل في فوف يتم تركيبها مع IRF المناسب. الأهم من ذلك، ر 0 يمكن أن تختلف ببطء مع مرور الوقت لذلك يجب أن تقاس قبل أي الحصول على البيانات FLIM.

يجب على المستخدم أن تقرر كيفية أخذ عينات من ملامح الاضمحلال مضان وهو مطلوب لتعيين عرض للبوابات الوقت والتأخير النسبية بعد الإثارة. بشكل عام، فمن المستحسن استخدام بعرض بوابة واسعة لتحقيق أقصى قدر من إشارة الكشف عن وعادة ما نستخدم بعرض بوابة المقرر أن 4 م لFLIM من الخلايا المسمى مع البروتينات مضان. يجب أن يكون عدد من التأخير البوابة الوقت الكافي لأخذ عينات من الشخصية تسوس فلوري (بما في ذلك البوابة مجموعة واحدة لقياس إشارة فقط قبل نبض الإثارة) نظرا لتعقيد النموذج المناسب التي سيتم استخدامها في التحليل. يمكن أن تعتمد القيمة المثلى على عمر وسعة النسبية للمكونات الاضمحلال. بشكل عام، 4 بوابات كافية لmonoexponential المناسب يضمحل في حين قد 7 أو أكثر البواباتيمكن استخدامها لمزيد من النماذج تسوس المعقدة.

ونلاحظ أن FLIM يمكن تنفيذها باستخدام مجموعة من التقنيات الساعة المجال أو مجال التردد وطبقت الآلية HCA FLIM صفائف لوحة multiwell أولا في (غير باجتزاء) المجهر واسعة المجال باستخدام قراءات عمر نطاق تردد من الحنق 51. ثم ورد أول الآلي البصرية باجتزاء FLIM قارئ لوحة multiwell لHCA استخدام حقل واسع بوابات وقت التصوير 28. وفي وقت لاحق، تم تطبيق على نطاق الحقل (غير باجتزاء) نطاق التردد FLIM HCA للكشف عن آخر التعديلات متعدية (التيروزين الفسفرة) عبر مكتبة الجينات باستخدام الحنق 52 و بوابات الوقت FLIM HCA تم تطبيقه على الحنق فحوصات فيروس نقص المناعة البشرية-1 الكمامة oligomerization 53 وSUMOylation من FOXM1 54 وRaichu RhoA وأجهزة الاستشعار RAC1 33. ومن الممكن أيضا استخدام TCSPC لmultiwell لوحة FLIM 26 ولكن حتى الآن أثبتت أنها صعبة لمباراة رانه مرت من تقنيات استغلال كشف واسعة المجال. نهج واحد الناشئة التي يمكن أن تعالج هذه المسألة هو استخدام المصفوفات للكشف عن العد فوتون واحد مثل المصفوفات SPAD 55.

ونلاحظ أن أي قراءات من الحنق باستخدام البروتينات الفلورية ينبغي أن يعامل بحذر وأن القيم المطلقة من المعلمات التي تم الحصول عليها من FLIMfit أو أي دولة أخرى برامج التحليل فليم سوف تعتمد على الافتراضات المرتبطة النموذج المناسب. على سبيل المثال، حيث المانحة الحنق لديه مكون الاضمحلال الثاني كبير، واستخدام نموذج biexponential لاحتواء البيانات الحنق FLIM يمكن أن يؤدي إلى مساهمة العنصر أسرع الاضمحلال، والتي ترتبط عادة مع السكان FRETing تظهر أعلى مما ينبغي. ولذلك فمن المستحسن استخدام الجهات المانحة مع عمر أحادية الأسي مثل mTq2FP. حتى ذلك الحين، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن تحليل الحنق لا تزال تتأثر الدول المظلمة من البروتينات متقبل مضان أو عن طريقعدم تجانس عامل التوجه κ 2 بسبب توزيع التشكل fluorophore مع مجموعة متنوعة من الزوايا حامل اللون والمسافات 56. ومع ذلك، نحن وغيرنا قد أظهرت أن قراءات مضان عمر الحنق لا تنتج النتائج المفيدة التي ترتبط مع القياسات البيوكيميائية، ويمكن استخدامها للكشف عن تفاعلات البروتين أو لمتابعة ديناميات هذه الأجهزة. وبالتالي هذا المنبر HCA openFLIM يمكن تطبيقها على مجموعة واسعة من فحوصات على أساس عمر مضان باستخدام الحنق أو تألق ذاتي الخلوية 8، فضلا عن توفير قراءات كمية من تحقيقات قائم على الأصباغ 25.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors gratefully acknowledge funding from the United Kingdom Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC BB/E003621/1, BB/H00713X/1 and BB/M006786/1), the UK Technology Strategy Board (Technology Award CHBT/007/00030, EP/C54269X, in partnership with AstraZeneca, GE Healthcare, GSK, Kentech Instruments Ltd) and the Wellcome Trust (WT 095931/Z/11/Z). FG acknowledges a PhD studentship from the UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC). DA, DK and SW acknowledge PhD studentships from the Institute of Chemical Biology EPSRC-funded Doctoral Training Centre.

Materials

microscope frame  Olympus IX81  http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf 
optical autofocus Olympus ZDC  http://www.olympusmicro.com/brochures/pdfs/ix71.pdf 
motorized (x-y-z) microscope stage Marzhauser 00-24-565-0000 Stage with Corvus controlle
excitation laser source Fianium SC400-4 Supercontinuum laser http://www.nktphotonics.com/product/sc400-4-compact-supercontinuum-laser/
gated optical intensifier  Kentech High Rate Imager (HRI)
delay generators Kentech — See agile delay generator and precision delay generator
camera Hamamatsu ORCA-ER-II
Nipkow disc scanner unit  Yokogawa CSU-X1  http://www.yokogawa.com/solutions/products-platforms/life-science/confocal-scanner-unit-csu/csu-x1/
Top hat diffuser Thorlabs ED1-S20-MD Engineered diffusers
mTq5V  Oxford Genetics P3850 mTurquoise Venus construct with 5 amino acid linker
mTq17V Oxford Genetics P3847 mTurquoise Venus construct with 17 amino acid linker
mTq32V Oxford Genetics P3848 mTurquoise Venus construct with 32 amino acid linker
mTq5A Oxford Genetics P3849 mTurquoise Amber construct
HEK293T — — cell type used
phenol red-free HBSS Sigma Aldrich 55021C-1000ML imaging media
culture media DMEM + 10%FBS + 0.5% Antibiotics
DMEM Sigma Aldrich D6046-500ML for culture media
FBS Sigma Aldrich 12003C-500ML for culture media
xTremeGene9 Sigma Aldrich 6.37E+09 for transfection, follow online protocol from La Roche
trypsin/EDTA Solution Thermo Fischer R001100 for detaching cells, follow online protocol from Thermo Fischer
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  2. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  3. Skala, M. C., et al. In vivo multiphoton microscopy of nadh and fad redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia. PNAS. 104 (5), 19494-19499 (2007).
  4. Datta, R., Alfonso-Garcıa, A., Cinco, R., Gratton, E. Fluorescence lifetime imaging of endogenous biomarker of oxidative stress. Sci Rep. 5, 9848 (2015).
  5. König, K., Uchugonova, A., Gorjup, E. Multiphoton fluorescence lifetime imaging of 3d-stem cell spheroids during differentiation. Microsc. Res. Tech. 74 (1), 9-17 (2011).
  6. Wright, B. K., et al. Nadh distribution in live progenitor stem cells by phasor-fluorescence lifetime image microscopy. Biophys. J. 103 (1), 7-9 (2012).
  7. Fite, B. Z., et al. Noninvasive Multimodal Evaluation of Bioengineered Cartilage Constructs Combining Time-Resolved Fluorescence and Ultrasound Imaging. Tissue Eng Part C Methods. 17 (4), (2011).
  8. Kelly, D. J., et al. An automated multiwell plate reading FLIM microscope for live cell autofluorescence lifetime assays. J. Innov. Opt. Health Sci. 7 (5), 1-15 (2014).
  9. Owen, D. M., et al. Fluorescence lifetime imaging provides enhanced contrast when imaging the phase-sensitive dye di-4-ANEPPDHQ in model membranes and live cells. Biophys. J. 90 (11), 80-82 (2006).
  10. Suhling, K., et al. Imaging the environment of green fluorescent protein. Biophys. J. 83 (6), 3589-3595 (2002).
  11. Nezu, A., Tanimura, A., Morita, T., Shitara, A., Tojyo, Y. A novel fluorescent method employing the FRET-based biosensor “LIBRA” for the identification of ligands of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptors. BBA-Gen Subjects. 1760 (8), 1274-1280 (2006).
  12. Nishioka, T., et al. Rapid Turnover Rate of Phosphoinositides at the Front of Migrating MDCK Cells. Mol. Biol. Cell. 19 (10), 4213-4223 (2008).
  13. Stockholm, D., et al. Imaging Calpain ProteaseActivity by Multiphoton FRET in Living Mice. J. Mol. Biol. 346 (1), 215-222 (2005).
  14. Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
  15. Mank, M., et al. FRET-Based Calcium Biosensor with Fast Signal Kinetics and High Fluorescence Change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
  16. Ueyama, H., Takagi, M., Takenaka, S. A novel potassium sensing in aqueous media by synthetic oligonucleotide derivative. Fluorescence resonance energy transfer associated with guanine quartet-potassium ion complex formation. J. Am. Chem. Soc. 124 (48), 14286-14287 (2002).
  17. Kuner, T., Augustine, G. J. A Genetically Encoded Ratiometric Indicator for Chloride: Capturing Chloride Transients in Cultured Hippocampal Neurons. Neuron. 27 (3), 447-459 (2000).
  18. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
  19. Gadella, T. W. J. Editor, FRET and FLIM Techniques, Volume 33. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology. , (2009).
  20. Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr. Opin. Biotech. 19 (4), 338-343 (2008).
  21. Aoki, K., Kiyokawa, E., Nakamura, T., Matsuda, M. Visualization of growth signal transduction cascades in living cells with genetically encoded probes based on Förster resonance energy. Phil. Trans. R. Soc. B. 363 (1500), 2143-2151 (2008).
  22. Welch, C. M., Elliott, H., Danuser, G., Hahn, K. M. Imaging the coordination of multiple signalling activities in living cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 749-756 (2011).
  23. Vogel, S. S., Thaler, C., Koushik, S. V. Fanciful FRET. Sci. Signal. 2006 (331), 2 (2006).
  24. Hoppe, A., Christensen, K., Swanson, J. A. Fluorescence resonance energy transfer-based stoichiometry in living cells. Biophys. J. 83 (6), 3652-3664 (2002).
  25. Kumar, S., et al. FLIM FRET technology for drug discovery: automated multiwell plate high content analysis, multiplexed readouts and application in situ. ChemPhysChem. 12 (3), 627-633 (2011).
  26. Barber, P. R., et al. The Gray Institute “open” high-content, fluorescence lifetime microscopes. J. Microsc. 251 (2), 154-167 (2013).
  27. Matthews, D. R., et al. A high-content screening platform utilizing polarization anisotropy and FLIM microscopy. Proc. of SPIE. 6859, 1-12 (2008).
  28. Matthews, D. R., et al. A Multi-Functional Imaging Approach to High-Content Protein Interaction Screening. PLOS ONE. 7 (4), e33231 (2012).
  29. Talbot, C. B., et al. High speed unsupervised fluorescence lifetime imaging confocal multiwell plate reader for high content analysis. J. Biophotonics. 1 (6), 514-521 (2008).
  30. Grant, D., et al. High speed optically sectioned fluorescence lifetime imaging permits study of live cell signaling events. Opt. Express. 15 (24), 15656-15673 (2007).
  31. Warren, S. C. Rapid global fitting of large fluorescence lifetime imaging microscopy datasets. PLOS ONE. 8 (8), e70687 (2013).
  32. . Github.com Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki (2016)
  33. Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. Advanced methods of microscope control using μManager software. J. of Biol. Methods. 1 (2), 11 (2014).
  34. Pelet, S., Previte, M., Laiho, L., So, P. A fast global fitting algorithm for fluorescence lifetime imaging microscopy based on image segmentation. Biophys J. 87 (4), 2807-2817 (2004).
  35. Kristoffersen, A. S., Erga, S. R., Hamre, B., Frette, &. #. 2. 1. 6. ;. Testing Fluorescence Lifetime Standards using Two-Photon Excitation and Time-Domain Instrumentation: Rhodamine B, Coumarin 6 and Lucifer Yellow. J. Fluoresc. 24 (4), 1015-1024 (2014).
  36. Koushik, S. V., Chen, H., Thaler, C., Puhl, H. L., Vogel, S. S. Cerulean, Venus, and VenusY67C FRET Reference Standards. Biophys. J. 91 (12), 99-101 (2006).
  37. Ono, A. HIV-1 assembly at the plasma membrane: Gag trafficking and localization. Future Virol. 4 (3), 241-257 (2009).
  38. Rizzo, M. A., Springer, G. H., Granada, B., Piston, D. W. An improved cyan fluorescent protein variant useful for FRET. Nat. Biotechnol. 22, 445-449 (2004).
  39. Koushik, S. V., Vogel, S. S. Energy migration alters the fluorescence lifetime of Cerulean: implications for fluorescence lifetime imaging Forster resonance energy transfer measurements. J. Biomed. Opt. 13 (3), 031204 (2008).
  40. Goncalves, V., et al. A fluorescence-based assay for N-myristoyltransferase activity. Anal. Biochem. 421 (1), 342-344 (2012).
  41. Lindwasser, O. W., Resh, M. D. Myristoylation as a target for inhibiting HIV assembly: Unsaturated fatty acids block viral budding. PNAS. 99 (20), 13037-13042 (2002).
  42. Iversen, P. W., Eastwood, B. J., Sittampalma, G. S., Cox, K. L. A Comparison of Assay Performance Measures in Screening Assays: Signal Window, Z’Factor, and Assay Variability Ratio. J Biomol Screen. 11 (3), (2013).
  43. Alibhai, D. . Fluorescence lifetime imaging applied to multiwell plate FRET assays for high content analysis. , (2013).
  44. Klarenbeek, J., Goedhart, J., van Batenburg, A., Groenewald, D., Jalink, K. Fourth-Generation Epac-Based FRET Sensors for cAMP Feature Exceptional Brightness, Photostability and Dynamic Range: Characterization of Dedicated Sensors for FLIM, for Ratiometry and with High Affinity. PLOS ONE. 10 (4), 0122513 (2015).
  45. Martins, M., et al. Activity of phospholipase C epsilon contributes to chemotaxis of fibroblasts towards platelet-derived growth factor. J. Cell Sci. 125, 5758-5769 (2012).
  46. . Github.com Available from: https://github.com/imperial-photonics/openFLIM-HCA/wiki/2-Hardware-reference (2016)
  47. McGinty, J., et al. Signal-to-noise characterization of time-gated intensifiers used for wide-field time-domain FLIM. J. Phys. D: Appl. Phys. 42, 135103 (2009).
  48. Boens, N., et al. Fluorescence Lifetime Standards for Time and Frequency Domain Fluorescence Spectroscopy. ACS. 79 (5), 2137-2149 (2007).
  49. Esposito, A., Dohm, C. P., Bähr, M., Wouters, F. S. Unsupervised Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy for High Content and High Throughput Screening. Mol. Cell. Proteomics. 6 (8), 1446-1454 (2007).
  50. Grecco, H. E., et al. In situ analysis of tyrosine phosphorylation networks by FLIM on cell arrays. Nat Meth. 7 (6), 467-472 (2007).
  51. Alibhai, D., et al. Automated fluorescence lifetime imaging plate reader and its application to Förster resonant energy transfer readout of Gag protein aggregation. J. Biophotonics. 6 (5), 398-408 (2012).
  52. Kelly, D. J., et al. Automated multiwell fluorescence lifetime imaging for Főrster resonance energy transfer assays and high content analysis. Anal. Methods. 7 (10), 4071-4089 (2015).
  53. Poland, S. P., et al. A high speed multifocal multiphoton fluorescence lifetime imaging microscope for live-cell FRET imaging. Biomed. Opt. Exp. 6 (2), 277-296 (2015).
  54. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., Van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLOS ONE. 8 (1), e49593 (2012).

Tags

Open SourceHigh Content AnalysisAutomatedFluorescence Lifetime Imaging MicroscopyFLIMMulti-well PlateGlobal AnalysisFRETTime-gatedLive Cell ImagingProtein InteractionsCell SignalingMicromanagerOpenFLIM-HCA PluginDelay Box CalibrationInstrument Response FunctionSpinning Disk UnitFast Delay Box

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Görlitz, F., Kelly, D. J., Warren, S. C., Alibhai, D., West, L., Kumar, S., Alexandrov, Y., Munro, I., Garcia, E., McGinty, J., Talbot, C., Serwa, R. A., Thinon, E., da Paola, V., Murray, E. J., Stuhmeier, F., Neil, M. A. A., Tate, E. W., Dunsby, C., French, P. M. W. Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy. J. Vis. Exp. (119), e55119, doi:10.3791/55119 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image