Методика изучения горизонтальных генного переноса в<em> Стафилококк</em
Summary
Мы опишем здесь три различные протоколы для исследования в пробирке конъюгации, трансдукции и естественной трансформации в золотистый стафилококк.
Abstract
Одной важной особенностью основных оппортунистических патогеном человека золотистый стафилококк является его исключительная способность быстро приобретают устойчивость к антибиотикам. Геномные исследования показывают , что S. стафилококк несет множество генов вирулентности и сопротивления , расположенные в мобильных генетических элементов, предполагая , что горизонтальный перенос генов (HGT) играет важную роль в эволюции золотистого стафилококка. Тем не менее, полное и подробное описание методологии , используемой для изучения HGT в золотистого стафилококка до сих пор отсутствует, особенно в отношении естественное преобразование, которое было недавно сообщалось в этой бактерии. Эта работа описывает три протокола, которые полезны для экстракорпоральное исследования ХГТ в золотистого стафилококка: конъюгации, трансдукции фагом и естественной трансформации. С этой целью, ген ЧФР (хлорамфеникол / сопротивления флорфеникол), которое дает Phenicols, Lincosamides, Оксазолидиноны, плевромутилины и стрептограминов А (PhLOPSА) -resistance фенотипом, был использован. Понимание механизмов , посредством которых золотистого стафилококка трансферты генетические материалы других штаммов имеет важное значение для осмысления быстрое приобретение сопротивления и помогает уточнить режимы распространения , представленные в программах наблюдения или для дальнейшего прогнозирования режима расширения в будущем.
Introduction
Золотистый стафилококк является синантропных грамположительные бактерии , которые , естественно , населяет кожу и носовую полость человека и животных. Этот бактериальный вид является основной причиной внутрибольничных инфекций в больницах и медицинских учреждениях. Кроме того, его способность к развитию устойчивости к различным антимикробным соединений сделало управление инфекций, вызванных этой бактерией в глобальную озабоченность.
Два основных пути, участвующие в распространении фенотипов сопротивления известны: клонального распространение устойчивых генотипов и распространения генетических детерминант среди бактерий бассейна. В случае золотистого стафилококка, различных генов устойчивости к антибиотикам (а также вирулентности детерминанты) , как было установлено, связаны с мобильными генетическими элементами (МГЭС) 1. Наличие этих элементов в геноме золотистого стафилококка указывает на то, что приобретение и передача генэтический материал в популяции бактерий может играть важную роль для адаптации стафилококка S. и эволюции.
Генетический материал может быть обменен через три хорошо известных механизмов ХГТ в грам-положительных бактерий: трансформации, конъюгации и трансдукции фага. Трансформация предполагает поглощение свободной ДНК. Для того, чтобы приобрести чужеродную ДНК, бактериальные клетки необходимо разработать специальную физиологическую фазу: стадия компетенции. При достижении этой стадии компетентные клетки способны транспортировать ДНК в цитоплазму, приобретая новые генетические детерминанты. В случае золотистого стафилококка, существование естественной трансформации было недавно продемонстрировано 2. В соответствии с этим, наша группа пролить свет на актуальность экспрессии фактора Вздох (зашифрованное вторичный фактор транскрипции Sigma) в стадии развития компетентности и о том , как его экспрессия гена оказывает золотистого стафилококка , способный Reachinг стадия компетентности, которая позволяет на приобретение устойчивых фенотипов путем естественной трансформации 2.
Сопряжение представляет собой процесс, включающий передачу ДНК из одной живой клетки (донора) к другому (получателю). Обе клетки должны находиться в непосредственном контакте, позволяя ДНК, подлежащей обмену в то время как защищен специальными составами, такими как трубы или поры. Перенос ДНК с помощью этого метода требует конъюгативная машины. В золотистого стафилококка, плазмиды прототип конъюгативная является PGO1, который таит в себе конъюгативных оперона Traa 3.
Фаг трансдукция включает в себя перенос ДНК от клетки к клетке через бактериофага инфекции и подразумевает упаковку бактериальной ДНК, вместо вирусной ДНК, в фага капсида. Большинство из золотистого стафилококка изолятов lysogenized бактериофагами 1. При стрессовых условиях, профаги может быть вырезан из бактериального геномае и сдвиг в сторону литического цикла.
Это три хорошо известные механизмы передачи ДНК в золотистого стафилококка. Есть некоторые дополнительные механизмы передачи, такие как "псевдо-трансформация» 2 и фаг-подобных систем в передаче патогенности островов 4. Недавно одна группа сообщила , что "Нанотрубки" участвуют в передаче клеточных материалов ( в том числе плазмидной ДНК) между соседними клетками 5, 6, но последующие исследования не появился из других групп до сих пор.
Эта работа обеспечивает необходимую методологию для изучения HGT в золотистого стафилококка путем решения трех основных путей передачи: конъюгация, трансдукция, и естественное преобразование. Результаты , полученные с помощью этих методик были использованы для изучения передачи СМО гена (хлорамфеникол / сопротивления флорфеникол) средиЗолотистого стафилококка штаммы 7. Эти три метода являются универсальными инструментами исследования передачи MGE в золотистого стафилококка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа описывает три основных метода для изучения HGT генетических детерминант в золотистого стафилококка. Хотя трансдукции и конъюгации были изучены в течение многих десятилетий, существование естественной трансформации лишь недавно был признан 2. Таким обра…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).
Materials
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Becton Dickinson | 211825 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | 211059 | |
| Nutrient Broth No. 2 | Oxoid | CM0067 | |
| Sheep blood agar | Eiken Chemical Co.,Ltd. | E-MR96 | Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. |
| Agar powder | Wako Pure Chemical Industries | 010-08725 | |
| Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) | Wako Pure Chemical Industries | 191-01785 | |
| Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter | Merck Milipore | HAWG 02500 | |
| QIAfilter Plasmid Midi kit | QIAGEN | 12243 |
References
- Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
- Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
- Caryl, J. A., O’Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
- Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
- Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
- Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
- Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
- Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
- Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
- Clinical Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically – Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , (2006).
- Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
- Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
- Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
- Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
- Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
- Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
- McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
- Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
- Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).
