Summary

In Situ Rilevazione e quantificazione di singola cellula delle nanoparticelle di ossido di metallo mediante analisi della microsonda del nucleare

Published: February 03, 2018
doi:

Summary

Descriviamo una procedura per l’individuazione di elementi chimici presenti in situ in cellule umane, nonché la loro quantificazione in vitro . Il metodo è adatto a qualsiasi tipo di cellula ed è particolarmente utile per l’analisi chimiche quantitative in singole cellule in vitro esposizione di nanoparticelle di ossido di metallo.

Abstract

Tecniche di micro-analitico basati su formazione immagine elemento chimico consentono la localizzazione e la quantificazione della composizione chimica a livello cellulare. Essi offrono nuove possibilità per la caratterizzazione dei sistemi viventi e sono particolarmente appropriati per rilevare, localizzare e quantificare la presenza di nanoparticelle di ossido di metallo sia in campioni biologici e per l’ambiente. Infatti, queste tecniche tutti i pertinenti requisiti in termini di (i) sensibilità (da 1 fino a 10 µg.g-1 di massa secca), (ii) micrometro gamma risoluzione spaziale e (iii) multi-elemento rilevamento. Date queste caratteristiche, formazione immagine di elemento chimico microbeam possa potentemente integrare tecniche di imaging routine come ottica e microscopia a fluorescenza. Questo protocollo viene descritto come eseguire un’analisi della microsonda nucleare su cellule in coltura (U2OS) esposte alle nanoparticelle di biossido di titanio. Le cellule devono crescere ed essere esposte direttamente in un portacampioni appositamente utilizzato il microscopio ottico e nelle fasi di analisi della microsonda nucleare. Tuffo-congelamento criogenica fissazione dei campioni conserva sia l’organizzazione e la distribuzione di elemento chimico. Analisi simultanea della microsonda nucleare (microscopia dello ione trasmissione, Rutherford backscattering spettrometria e particella indotto da emissione di raggi x) eseguita sul campione fornisce informazioni circa la densità cellulare, la distribuzione locale di gli elementi chimici, come pure il contenuto cellulare di nanoparticelle. C’è un crescente bisogno di tali strumenti analitici all’interno di biologia, soprattutto in ambito emergente di nanotossicologia e nanomedicina per cui occorre approfondire la nostra comprensione delle interazioni tra nanoparticelle e campioni biologici. In particolare, come analisi della microsonda nucleare non richiedono le nanoparticelle siano etichettati, abbondanze di nanoparticelle sono quantificabili fino al livello di singola cellula in una popolazione di cellule, indipendentemente dal loro stato superficiale.

Introduction

L’omeostasi cellulare è determinato dal controllo di assorbimento, assimilazione e localizzazione intracellulare di diversi oligoelementi (ioni, metalli, composti inorganici esogeni). Questi componenti sono frequentemente sotto forma di tracce, ma tuttavia possono avere un impatto considerevole nella fisiologia del sistema. Così, lo studio della biochimica cellulare in situazioni sia normali che patologiche/sottolineato è un chiave-passo verso una comprensione globale dei meccanismi metabolici cellulari. Di conseguenza, lo sviluppo di tecniche di imaging e analitiche che consente l’indagine delle abbondanze chimiche intracellulari, organizzazione strutturale e delle funzioni metaboliche correlate diventa necessario. Metodi molto pochi sono in grado di fornire un pezzo di in situ quantitativa di informazioni riguardanti la natura chimica complessiva di un dato campione. Oltre a metodi di analisi dei campioni in forma bulk, analisi in situ considerano campioni biologici nella loro integralità senza perdere le informazioni strutturali e massa, preservando così le loro sostanze chimiche (oligoelementi e ioni) e proteine. Inoltre, come le nanoscienze continuano a sviluppare, formazione immagine migliorata e metodi analitici per il monitoraggio ambientale su scala cellulare sarà necessari osservare e quantificare le interazioni e comportamenti di nano-oggetto. 1

Le nanoparticelle (NP) sono state definite come oggetti che esibiscono almeno una dimensione facciale nell’intervallo da 1 e 100 nm. 2 a causa di loro particolari proprietà fisico-chimiche, NPs sono ampiamente utilizzati nell’industria. Dei criteri di rete sono impiegati in bio-applicazioni e nella nanomedicina. 3 , 4 nonostante le numerose caratteristiche fisico-chimiche di NPs, potrebbero generare alcuni rischi di effetti negativi sulla salute umana e l’ambiente. Questi rischi possono essere indotti da esposizioni sia prolungate e ripetitive a vari livelli di concentrazione e questo non è ancora stata chiaramente stabilito. 5 , 6 , 7 , 8 In particolare, il destino di NPs all’interno di cellule e le risposte cellulari associate sono, ad oggi, non completamente descritto. Ciò è in parte dovuto la scarsità di metodi che consentono la rilevazione e quantificazione di NPs interiorizzata in una singola cella. 9

Gli strumenti analitici classici usati per stimare la dose cellulare delle nanoparticelle sono microscopie, spettrometria di massa (MS), accoppiato induttivamente al plasma (ICP-MS) MS10,11 e cromatografia liquida (LC-MS) MS, ma forniscono solo informazioni utili su scala macroscopica. Nessuno di loro può fornire una valutazione precisa del contenuto NPs subcellulare né la distribuzione dei criteri di rete senza l’uso di metodi di frazionamento. Una valutazione sistematica della dose-risposta è dunque impossibile con questi metodi, in contrasto con metodi basati sulla spettroscopia atomica come microsonda nucleare analisi12,13, microscopia di fluorescenza di raggi x di sincrotrone14 e spettrometria di massa di ioni secondari (SIMS). 15 , 16 questi metodi sono particolarmente interessanti come si completano le osservazioni fatte utilizzando la microscopia a fluorescenza, soprattutto quando NPs non possono essere etichettati con molecole fluorescenti e sono quindi studiati nel loro stato nativo. In una certa misura, anche quando NPs si innestano con fluorofori, (i) quantificazione rimane difficile perché il livello di codifica per NP è sconosciuto e (ii) la modificazione chimica della superficie NP può modificare la sua distribuzione cellulare.

In questo articolo, ci concentriamo su un metodo basato su una combinazione di tecniche nucleari della microsonda puntando la morfologia e la composizione elementare di campioni biologici in maggiore, minore, di imaging e le concentrazioni di traccia.

Analisi della microsonda nucleare dimostra di essere particolarmente adatto per la misura di elementi chimici in traccia nei tessuti biologici. La risoluzione laterale fascio (0.3-1 µm) e la sensibilità nella rilevazione di elemento chimico (da 1 a 10 µg.g-1 massa secca) sono adatti per studi a livello cellulare. Nucleare della microsonda tecniche si basano sulla rilevazione di particelle (fotoni, elettroni, ioni) generato dopo che il fascio di ioni (in genere in esecuzione alle energie di MeV) interagisce con gli atomi presenti nel campione. Interazioni che si verificano nelle cellule sono principalmente: 1) eccitazione/ionizzazione degli atomi seguita da un’emissione di fotoni dopo atomi tornano allo stato fondamentale; e 2) diffusione delle particelle in arrivo che porta a cambiare nella loro energia e direzione. La misurazione di identificazione permette di particella emessa energia degli atomi coinvolti nell’interazione. Per eseguire il mapping di elementi, la microbeam ione viene analizzato ripetutamente sopra la superficie del campione, spesso su una superficie di circa 100 da 100 µm2 contengono parecchie cellule. Particelle emesse vengono rilevate e la loro energia è registrato per ogni posizione di fascio. L’ordinamento delle particelle in base alla posizione di fascio, identificando così la struttura responsabile per l’emissione di tali particelle è lo scopo del trattamento dei dati. Qui, descriviamo precisamente un approccio basato sulla microscopia a fluorescenza e analisi nucleari della microsonda per rilevare così come quantificare esogeno NPs alla scala cellulare e subcellulare, al fine di indagare le conseguenze delle interazioni di NP con soggiorno sistemi. Ci concentreremo in particolare sulle opportunità offerte da questo metodo in termini di quantificazione in situ di biossido di titanio (TiO2 NPs) nanoparticelle aggregati a livello subcellulare.

Protocol

1. titolare preparazione del campione Preparazione e progettazione titolare campione Fabbricare un portacampioni perforando un quadrato di 5 x 5 mm in una cornice PEEK spessa 1 mm. Risciacquo con etanolo 70% (v/v) per pulire e mantenere in piastre sterili fino all’uso.Nota. Un titolare di campione appropriato per colture cellulari e la manipolazione delle cellule è richiesto. Esso deve essere progettato per cella coltura, osservazioni in vitro con microscopia…

Representative Results

Coltura delle cellule e formazione immagine di fluorescenza del TiO fluorescente contrassegnato 2 NPs Abbiamo progettato un portacampioni adattato per coltura cellulare, la gestione delle cellule come pure analisi multimodale. In particolare, era importante che il titolare consentito microscopia ottica sistematica come bene come nucleare analisi della microsonda e ima…

Discussion

Descriviamo un metodo che fornisce informazioni utili di là di ciò che è possibile con altre tecniche di imaging, soprattutto a livello subcellulare. Oltre alla sua capacità di imaging, analisi della microsonda nucleare offre anche possibilità di quantificazione degli elementi chimici che entrano nella composizione di un campione biologico. Nel lavoro attuale, abbiamo studiato le popolazioni delle cellule umane e concentrata verso il basso per l’analisi di una regione selezionata di interesse basato su una singola c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Serge Borderes per regia e montaggio del video. La French National Research Agency supporta il programma di ricerca Titani (ANR CES 2010, n ° CESA 01 009). Il CNRS e la Comunità europea come un’attività di integrazione fornito il “supporto di pubblico e industriale ricerca utilizzando Ion fascio tecnologia (spirito)” sotto il CE contratto n ° 227012. Quest’opera è stata sostenuta da azioni Marie Curie – reti di formazione iniziale (ITN) come un “integrando attività di supporto post-laurea ricerca con stages in industria e formazione d’eccellenza” (SPRITE, D1.3) sotto contratto CE n. 317169. C’NANO Grand Sud Ouest e la regione Aquitania supportano il programma di ricerca TOX-NANO (n ° 20111201003) e il programma di ricerca POPRA (n ° 14006636-034).

Materials

Cell culture
U2OS ATCC, LGC STANDARDS ATCC HTB-96
Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine Dominique DUTSCHER L0211-500
FBS 500 mL Dominique DUTSCHER 500105U
Penicillin/Streptomycin  ThermoFisher Scientific 11548876
 L-Glutamine 200 mM, 100 mL  Invitrogen 25030024
Geneticin,  20 mL ThermoFisher Scientific 10092772
Trypsin-EDTA 0.25% (v/v)  500 mL ThermoFisher Scientific 11570626
Viromer Red Lipocalyx VR-01LB-01
Matrix-roGFP Plasmid AddGene #49437
Hoechst 33342 ThermoFisher Scientific H3570 Handle with care
NPs preparation
TiO2 P25 AEROXIDE Degussa/Evonik
Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) SIGMA-ALDRICH T3163 Surface modification of NPs
Sample preparation
Polycarbonate foil Goodfellow CT301020
Polyether Ether Ketone support (PEEK) Matechplast A-239-4047
Ethanol, ACS absolute SIGMA-ALDRICH 02860-6x1L
Chlorform, Anhydrous, 99% SIGMA-ALDRICH 372978-1L  Caution toxic
Formvar 100 g Agar Scientific AGR1201 Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform
NaOH SIGMA-ALDRICH S5881-500G
Sample fixation
Powder, 95% Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH 158127-500G Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS
PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) ThermoFisher Scientific 11503387
Prolong Gold Antifade Reagent ThermoFisher Scientific P36934
Triton X-100 SIGMA-ALDRICH 93443 Harmful
Sample cryofixation
Liquid nitrogen air liquids sante Harmful
Methylbutane >=99% SIGMA-ALDRICH  M32631-1L Caution toxic
Aluminium transfer plate Home-made
Distilled and deionized water Home-made Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system
Parafilm VWR 52858-000
Equipment
Barnstead Smart2Pure ThermoFisher Scientific 50129870
Biosafety bench, class II ThermoFisher Scientific MSC-Advantage
TC20 automated cell counter Biorad 145-0102SP
Counting slides 2 wells Biorad 1450016
PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV Canberra  PD25-12-100AM
High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα Oxford Instruments
Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED)  Orsay Physics 1-SED
XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl Micromatter 34381
XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 Micromatter 34382
XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal Micromatter 34383
XRF Calibration Standard Silicon as SiO Micromatter 34384
XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx Micromatter 34385
XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 Micromatter 34387
XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal Micromatter 34388
XRF Calibration Standard Iron as Fe metal Micromatter 34389
Sonicator 750W Sonics Materials 11743619
3MM microprobe Bioblock scientific 220-05
Lyophilizer in vacuum Elexience EK3147
Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 431006-9901
Motorized stage xy Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 432031-9902
EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420351-9910
Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 420781-9910
Zeiss filterset 02 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 488002-9901
Zeiss filterset 38HE Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 489038-9901
Zeiss filterset 31 Carl Zeiss MicroImaging, GmbH 000000-1031-350
Chemical fume hood Erlab Captair SD321
Particle accelerator HVEE singletron
Software
ImageJ software National Institutes of health, USA ImageJ 1.51
SimNRA software Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany SIMNRA 6.06
Gupix software Guelph university, Canada GUPIXWIN 2.2.4

References

  1. Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
  2. Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
  3. Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
  4. Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
  5. Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety – A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
  6. Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies – A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
  7. Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
  8. Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
  9. Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
  10. Olesik, J. W. . Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , (2014).
  11. Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
  12. Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
  13. Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
  14. Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
  15. Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
  16. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
  17. Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
  18. Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  19. Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  20. Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
  21. Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
  22. Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
  23. Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
  24. Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
  25. Mayer, M. . SIMNRA User’s Guide, Report IPP 9/113. , (1997).
  26. Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
  27. Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).

Play Video

Cite This Article
Muggiolu, G., Simon, M., Lampe, N., Devès, G., Barberet, P., Michelet, C., Delville, M., Seznec, H. In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis. J. Vis. Exp. (132), e55041, doi:10.3791/55041 (2018).

View Video