In Situ Rilevazione e quantificazione di singola cellula delle nanoparticelle di ossido di metallo mediante analisi della microsonda del nucleare

L’omeostasi cellulare è determinato dal controllo di assorbimento, assimilazione e localizzazione intracellulare di diversi oligoelementi (ioni, metalli, composti inorganici esogeni). Questi componenti sono frequentemente sotto forma di tracce, ma tuttavia possono avere un impatto considerevole nella fisiologia del sistema. Così, lo studio della biochimica cellulare in situazioni sia normali che patologiche/sottolineato è un chiave-passo verso una comprensione globale dei meccanismi metabolici cellulari. Di conseguenza, lo sviluppo di tecniche di imaging e analitiche che consente l’indagine delle abbondanze chimiche intracellulari, organizzazione strutturale e delle funzioni metaboliche correlate diventa necessario. Metodi molto pochi sono in grado di fornire un pezzo di in situ quantitativa di informazioni riguardanti la natura chimica complessiva di un dato campione. Oltre a metodi di analisi dei campioni in forma bulk, analisi in situ considerano campioni biologici nella loro integralità senza perdere le informazioni strutturali e massa, preservando così le loro sostanze chimiche (oligoelementi e ioni) e proteine. Inoltre, come le nanoscienze continuano a sviluppare, formazione immagine migliorata e metodi analitici per il monitoraggio ambientale su scala cellulare sarà necessari osservare e quantificare le interazioni e comportamenti di nano-oggetto. ¹

Le nanoparticelle (NP) sono state definite come oggetti che esibiscono almeno una dimensione facciale nell’intervallo da 1 e 100 nm. ² a causa di loro particolari proprietà fisico-chimiche, NPs sono ampiamente utilizzati nell’industria. Dei criteri di rete sono impiegati in bio-applicazioni e nella nanomedicina. ^{3 , 4} nonostante le numerose caratteristiche fisico-chimiche di NPs, potrebbero generare alcuni rischi di effetti negativi sulla salute umana e l’ambiente. Questi rischi possono essere indotti da esposizioni sia prolungate e ripetitive a vari livelli di concentrazione e questo non è ancora stata chiaramente stabilito. ^{5 , 6 , 7 , 8} In particolare, il destino di NPs all’interno di cellule e le risposte cellulari associate sono, ad oggi, non completamente descritto. Ciò è in parte dovuto la scarsità di metodi che consentono la rilevazione e quantificazione di NPs interiorizzata in una singola cella. ⁹

Gli strumenti analitici classici usati per stimare la dose cellulare delle nanoparticelle sono microscopie, spettrometria di massa (MS), accoppiato induttivamente al plasma (ICP-MS) MS^10,11 e cromatografia liquida (LC-MS) MS, ma forniscono solo informazioni utili su scala macroscopica. Nessuno di loro può fornire una valutazione precisa del contenuto NPs subcellulare né la distribuzione dei criteri di rete senza l’uso di metodi di frazionamento. Una valutazione sistematica della dose-risposta è dunque impossibile con questi metodi, in contrasto con metodi basati sulla spettroscopia atomica come microsonda nucleare analisi^12,13, microscopia di fluorescenza di raggi x di sincrotrone¹⁴ e spettrometria di massa di ioni secondari (SIMS). ^{15 , 16} questi metodi sono particolarmente interessanti come si completano le osservazioni fatte utilizzando la microscopia a fluorescenza, soprattutto quando NPs non possono essere etichettati con molecole fluorescenti e sono quindi studiati nel loro stato nativo. In una certa misura, anche quando NPs si innestano con fluorofori, (i) quantificazione rimane difficile perché il livello di codifica per NP è sconosciuto e (ii) la modificazione chimica della superficie NP può modificare la sua distribuzione cellulare.

In questo articolo, ci concentriamo su un metodo basato su una combinazione di tecniche nucleari della microsonda puntando la morfologia e la composizione elementare di campioni biologici in maggiore, minore, di imaging e le concentrazioni di traccia.

Analisi della microsonda nucleare dimostra di essere particolarmente adatto per la misura di elementi chimici in traccia nei tessuti biologici. La risoluzione laterale fascio (0.3-1 µm) e la sensibilità nella rilevazione di elemento chimico (da 1 a 10 µg.g^-1 massa secca) sono adatti per studi a livello cellulare. Nucleare della microsonda tecniche si basano sulla rilevazione di particelle (fotoni, elettroni, ioni) generato dopo che il fascio di ioni (in genere in esecuzione alle energie di MeV) interagisce con gli atomi presenti nel campione. Interazioni che si verificano nelle cellule sono principalmente: 1) eccitazione/ionizzazione degli atomi seguita da un’emissione di fotoni dopo atomi tornano allo stato fondamentale; e 2) diffusione delle particelle in arrivo che porta a cambiare nella loro energia e direzione. La misurazione di identificazione permette di particella emessa energia degli atomi coinvolti nell’interazione. Per eseguire il mapping di elementi, la microbeam ione viene analizzato ripetutamente sopra la superficie del campione, spesso su una superficie di circa 100 da 100 µm² contengono parecchie cellule. Particelle emesse vengono rilevate e la loro energia è registrato per ogni posizione di fascio. L’ordinamento delle particelle in base alla posizione di fascio, identificando così la struttura responsabile per l’emissione di tali particelle è lo scopo del trattamento dei dati. Qui, descriviamo precisamente un approccio basato sulla microscopia a fluorescenza e analisi nucleari della microsonda per rilevare così come quantificare esogeno NPs alla scala cellulare e subcellulare, al fine di indagare le conseguenze delle interazioni di NP con soggiorno sistemi. Ci concentreremo in particolare sulle opportunità offerte da questo metodo in termini di quantificazione in situ di biossido di titanio (TiO₂ NPs) nanoparticelle aggregati a livello subcellulare.