JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
암 연구학

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Published: December 26, 2016
doi:
10.3791/54903
, ,
1Department of Cell, Developmental and Cancer Biology,Oregon Health and Science University

Summary

A surgical procedure was developed to deliver mammary tumor cells to the murine liver via portal vein injection. This model permits investigation of late stages of liver metastasis in a fully immune competent host, including tumor cell extravasation, seeding, survival, and metastatic outgrowth in the liver.

Abstract

Borstkanker is de belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte bij vrouwen wereldwijd. Levermetastasen is betrokken bij ruim 30% van de gevallen van borstkanker metastase, en resulteert in slechte resultaten met een mediane overleving van slechts 4,8-15 maanden. Huidige knaagdiermodellen van borstkanker metastasen, waaronder primaire tumorcel xenograft spontane tumormodellen zelden uitzaaien naar de lever. Intracardiale injectie en milt modellen resulteren in levermetastasen, maar deze modellen kunnen worden door gelijktijdig toegediende secundaire locatie metastase, of door stoornissen van het immuunsysteem door verwijdering van de milt tumorgroei op de injectieplaats te vermijden. Om de behoefte aan verbeterde levermetastasen modellen, een murine poortader injectiemethode dat tumorcellen levert enerzijds en rechtstreeks naar de lever ontwikkeld pakken. Dit model levert tumorcellen naar de lever zonder complicaties gelijktijdige uitzaaiingen in andere organen of verwijdering van de milt. de optimized poortader protocol maakt gebruik van kleine injectie volumes van 5-10 ul, ≥ 32 naalden, en hemostatische gaasje op de injectieplaats te controleren voor bloedverlies. De poortader injectie benadering in Balb / c vrouwtjesmuizen op drie syngene borsttumor lijnen van variërende metastatisch vermogen getest; high-metastatische 4T1 cellen, matige metastatische D2A1 cellen en low-metastatische D2.OR cellen. Concentraties van ≤ 10.000 cellen / injectie resulteert in een vertraging van ~ 20 – 40 dagen voor de ontwikkeling van leveruitzaaiingen met de hogere uitgezaaide 4T1 en D2A1 lijnen, en> 55 dagen voor de minder agressieve D2.OR lijn. Dit model is een belangrijk instrument om de uitzaaiing van borstkanker onderzoeken naar de lever, en kunnen van toepassing zijn op andere vormen van kanker die vaak uitzaaien naar de lever met inbegrip van colorectale en pancreas adenocarcinomen zijn.

Introduction

Uitzaaiing van borstkanker aan de lever

De lever is een gemeenschappelijk terrein van de uitzaaiing van borstkanker, samen met been en longen 1-3. Lever uitzaaiingen bij patiënten met borstkanker is een onafhankelijke prognostische factor voor zeer slechte resultaten 4,5, zoals mediane overleving van borstkanker patiënten met levermetastasen bereik 4,8-15 maanden 6-9. Daarentegen borstkankerpatiënten met long- of bot metastase mediane overleving van 9-27,4 maanden 8,9 en 16,3-56 maanden 8,10-12 respectievelijk. Metastase is een meerstaps werkwijze, aangeduid als de metastatische cascade, die begint met tumorcelverspreiding in de primaire tumor en eindigt bij de patiënt mortaliteit vanwege het zaaien en uitgroei van circulerende tumorcellen bij een afgelegen orgaan 13-15. Knaagdiermodellen van metastase is gebleken dat de metastatische cascade opmerkelijk inefficiënt, met slechts 0,02 – 10%van circulerende tumorcellen oprichting van openlijke metastase 16,17. Een belangrijk knelpunt van metastatische inefficiëntie wordt bepaald door de unieke weefsel microenvironments op secundaire plaatsen, de zogenaamde metastatische niches 18, met de nadruk op het belang van begrip site-specific metastase. De metastatische niche is uniek voor de plaats van recidief en wordt gedeeltelijk gekenmerkt door afzetting van extracellulaire matrixeiwitten afzonderlijke 19,20, infiltratie van verschillende immuuncel populaties 21-23 en veranderde weefselhomeostase inbegrip ontregelde productie van verschillende cytokinen, chemokines en groeifactoren 15,18,24,25. Aldus inzicht in de weefselspecifieke metastatische niche vooraf begrijpen hoe targeten metastatische ziekte. Echter, robuuste modellen van de lever metastase ontbreken. Verder zal verbeterde modellen van de lever metastase van essentieel belang voor het identificeren van nieuwe targets en effectieve behandelingen voor patiënten met borstkanker wi zijnth levermetastasen.

Gevestigde modellen om te studeren de uitzaaiing van borstkanker aan de lever

Op dit moment beschikbare modellen aan de uitzaaiing van borstkanker onderzoeken naar de lever omvatten menselijke kankercel xenotransplantaten in immuungecompromiteerde muizen. Deze modellen gebruiken meestal goed bestudeerde humane borstkankercellijnen zoals MCF-7 en MDA-MB-231 en Naakt, RAG1 – / – of SCID immuungecompromiteerde muizengastheren 26-29. Xenograft modellen bieden het voordeel dat met mensen afgeleide kankercellijnen, Gezien de recente appreciatie van immuuncellen in metastase 30-32 en 33-35 therapeutische weerstand, de studie van metastase in een volledig immunocompetente gastheer voorop. Modellen borstkankermetastasen studie naar de lever in immuuncompetente gastheren omvatten orthotope injecteren van syngene tumorcellen (bv 4T1 en D2A1 cellijnen) in de uiervet pad, met of zonder chirurgischeresectie van de primaire tumor en daaropvolgende beoordeling van metastase 36-38. Opmerkelijk is de snelheid van levermetastasen van orthotope transplantatie modellen zeer gering of nihil is vergeleken met andere metastasen zoals long- 39,40 of optreedt na longmetastasen wordt vastgesteld, bemoeilijkt de studie van lever-specifieke metastase 37,39 .

Tumor explantaten uit spontane genetisch gemanipuleerde borstkankermodellen kan opnieuw geïnjecteerd in de borstklier vetkussentjes naïeve gastheren syngene tumorcellen. Zo werd onlangs gemeld dat spontane tumoren van K14 Cre Ecad f / f P53 f / f muizen, die model invasief lobulair mammacarcinoom, het ontwikkelen van tumoren bij orthotopically geïnjecteerd in wild-type gastheren. Na chirurgische resectie van deze tumoren eenmaal bereikt 15 mm 2, 18% van de muizen ontwikkeld tot levermetastasen 40,41. Een derde benadering te modelleren lever metastase maakt gebruikspontane metastase in genetisch gemanipuleerde muizen. Tot op heden zijn meldingen van spontane muismodellen van de uitzaaiing van borstkanker die gemakkelijk verspreiden naar de lever zijn ongewoon. Uitzonderingen zijn de H19-IGF2, het p53 fp / fp MMTV-Cre Wap-Cre en de K14 Cre Ecad f / f P53 f / f genetisch gemanipuleerde muis-modellen, waarbij de lever metastase ontwikkelt zich in een laag percentage muizen 38,41- 43. Terwijl dus genetisch gemanipuleerde muismodellen de studie van alle stadia van de metastatische cascade, zorgt voor een krachtige en klinisch relevante modellen te vergemakkelijken, worden zij beperkt door lage of levermetastasen 38.

Verschillende modellen metastase voorbij de eerste stappen van de metastatische cascade zoals verspreiding van tumorcellen van de primaire tumor en intravasation. Deze modellen toestaan ​​onderzoek naar de latere stappen van de metastatische cascade, van extravasatie tot oprichting van tumoren op secundaire plaatsen. de intracardiac injectiemodel levert tumorcellen in de linker ventrikel, die tumorcellen verdeelt in de bloedsomloop via de aorta. Intracardiale injectie vereist echogeleide beeldvorming van de injectieplaats of andere beeldvormende technieken zoals bioluminescentie van luciferase tagged cellen om een ​​succesvolle injectie bevestigen. Injectie van tumorcellen via het linker ventrikel kan in bot, hersenen, longen en / of levermetastasen, onder andere organen 44-48. Vanwege meerdere organen metastasen, deze muizen moeten vaak worden gedood voorafgaand aan de ontwikkeling van openlijke lever metastase, ontkenning van de mogelijkheid om grondig te onderzoeken metastatische groei binnen de lever. Een alternatieve benadering die aanzienlijk vermindert de ontwikkeling van multi-site metastase is de milt injectie model. Milt injectie levert tumorcellen via de milt ader die zich aansluit bij de ader mesenterica superior naar de poortader 49,50 geworden. Dieren kunnen worden gecontroleerd op outgrowth van metastatische lesies in de lever vanwege vorming van metastasen op andere plaatsen is zeldzaam, en dientengevolge wordt de algehele gezondheid van het dier gehandhaafd 49,50. Het is echter belangrijk op te merken dat de milt model vereist splenectomie aan milt tumoren 49,50 vermijden, een procedure die invloed immuunfunctie. Zo wordt myocardiale ischemie reperfusie letsel gekenmerkt door infiltratie van monocyten Ly6C + subsets die afkomstig zijn van de milt en zijn verantwoordelijk voor de fagocytische en proteolytische activiteit tijdens de wondgenezing na ischemie 51,52. Met splenectomie, er een verlaging waargenomen monocyten populaties die helpen bij wondgenezing 52. Verder is splenectomie aangetoond dat primaire tumorgroei en longmetastasen verminderen in een niet-kleincellig longcarcinoom model, met name door vermindering van het aantal circulerende en intra-tumor CCR2 + CD11b + Ly6C + monocytische myeloid cellen 53. Bovendien, splenectomie milt na injectie van darmkankercellen in een afname in niveaus van anti-tumor NK cellen mesenteriale lymfeknopen en verhoogde levermetastasen 54. Kortom, deze bevindingen suggereren dat splenectomy compromitteert de rol van het immuunsysteem met verdere gevolgen voor uitgezaaide lot van de cel.

Poortader Injectie Model van de lever metastase

Om te onderzoeken borstkanker uitzaaiingen naar de lever in een volledig immuun bevoegde gastheer, onder omstandigheden waarin de muizen niet in het gedrang komen als gevolg van meerdere organen metastasen, werd een poortader injectie model ontwikkeld. Intraportale injectie modellen zijn eerder gebruikt om levermetastasen van colorectale 55,56 en melanoma 16 cellijnen te bestuderen; Hier beschrijven we de toepassing van de intraportale injectie mammaire syngene tumorcel metastase model. Dit model kan worden gebruikt voor onderzoekde latere stadia van de metastatische cascade waaronder borstkanker cel extravasatie en zaaien, tumorcel lot beslissingen over death / proliferatie / latentie en uitgroei in openlijke laesies. In dit model worden syngene mammaire tumorcellijnen geïnjecteerd via de poortader van immuuncompetente Balb / c vrouwtjesmuizen, een methode die tumorcellen levert enerzijds en rechtstreeks naar de lever zonder verwijdering van de milt. Om dit model, het gebruik van vier borsttumor cellijnen die variëren in hun gemetastaseerde vermogen van laag naar hoog werden gebruikt ontwikkelen: D2.OR, D2A1 en 4T1, en hebben in dienst D2A1 getagd met groen fluorescerend eiwit (D2A1-GFP) naar onderzoeken vroege tijdstippen na de injectie van tumorcellen. 4T1 is een zeer metastatische cellijn afgeleid van de 410,4 tumor die spontaan ontstaan in een MMTV + Balb / c vrouwtjes 36,37 en uitzaaiing longen, lever, hersenen en bot van uiervet pad primaire tumoren 39,57,58. D2A1 tumorcellen were ook oorspronkelijk afkomstig van een spontane borsttumor afkomstig uit een Balb / c gastheer na transplantatie van D2 hyperplastische alveolaire knobbel cellen en bevestigd metastatische uit de primaire tumor kunnen zijn voor de longen 59,60. D2.OR tumorcellen een niet-uitgezaaide zus lijn naar de D2A1 lijn en, hoewel ze de primaire tumor te ontsnappen en komen op secundaire locaties, ze zelden metastasen 60,61 vast te stellen.

Bovendien is het belangrijk om gebruik te maken van gewoonlijk toegepaste pijnbestrijding geneesmiddelen zoals niet-steroïdale anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAIDs) gedurende of na de operatie te voorkomen. NSAID's hebben anti-tumor activiteit in bepaalde borstkankers 62-65, en sommige klassen NSAID verhogen het risico op hepatotoxiciteit 66,67, mogelijk ten koste van de studie levermetastasen en de lever metastatische niche. Verder, studies suggereren dat NSAID's direct van invloed zijn het weefsel micro-omgeving, waardoor de pro-metastatische extracellular matrixeiwitten tenascine-C 68 en fibrillair collageen 62,65. Als alternatief, het gebruik van een opioïde derivaat, buprenorfine, werd gebruikt vanwege de werkzaamheid bij knaagdieren pijnbestrijding 69 en vanwege het gebrek aan bewijs dat opioïden antitumoractiviteit 70. Deze poortader injectiemodel geoptimaliseerd voor kleinere injectievolume van 5-10 gl onnodige schade aan de lever te voorkomen. Het model werd ook geoptimaliseerd naalden met kleinere diameter (≥ 32 gauge) en het gebruik van hemostatische gaas onmiddellijk na injectie om bloedverlies te minimaliseren tijdens de procedure omvatten. In tegenstelling tot deze geoptimaliseerde inspuitparameters moet aantal cellen worden bepaald op een individuele basis, gebaseerd op de tumorgeniciteit de cellijn. Echter, te beginnen bij ≤ 10.000 cellen / injectie voor de lange termijn studies wordt aanbevolen. Voor kortere eindpunten (bijvoorbeeld, 24 uur na injectie) aanzienlijk tumorcellen (bv1 x 05-01 oktober x 10 6) kan gebruikt worden als gerechtvaardigd. Samengevat, de poortader injectiemodel hier beschreven is een nuttig hulpmiddel voor de studie van borstkanker metastase naar de lever omzeilt en een aantal andere beperkingen levermetastasen modellen. Dit model maakt onderzoek van tumorcel extravasatie enten vroege beslissingen over het lot van de overleving, proliferatie en latentie en metastatische uitgroei in immuuncompetente muizen gastheren.

Protocol

Alle dierlijke procedures in dit artikel zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Oregon Health & Science University Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd. 1. Voorbereiding van de chirurgische gebied en instrumenten Bereid de scharen, forceps, en hemostat autoclaaf bij 124 ° C gedurende 30 min, 1-2 dagen voor de geplande ingrepen. Zorgen voor toegang tot geautoclaveerd of steriel beddengoed, kooien, en voedsel voor post-operatieve herstel. Bereid een aseptische chirurgische gebied, bij voorkeur in een laminaire stroming kap. Veeg alle oppervlakken van het chirurgische gebied met 10% bleekmiddel, inclusief verwarmingselement, lichtbron, anaesthesie buizen en neuskegel, en andere delen van de operatiekamer die in de nabijheid van de chirurgische ingreep terwijl deze wordt uitgevoerd . In de aseptische chirurgische gebied, plaats het schoongemaakte verwarming pad met steriel laken, lichtbron, anesthesie buizen en neuskegel, insuline spuiten, 1 ml spuiten, bupivacaïne, kunsttranen, steriele zoutoplossing, 2 x 2 "steriel gaasje sponzen, 4 x 4" steriel gaasje, hemostatische gaas gesneden in 0,5-1 cm 2 stuks, schaar, pincet, hemostat, 4-0 Vicryl hechtingen met conische naald en 50 ml 2% chloorhexidine gluconaat in een autoclaaf behandelde container. Zorg ervoor dat er ruimte is in deze ruimte voor bereidingen tumorcellen op ijs bewaard. Op de bank naast de chirurgische gebied, de voorbereiding van het herstel gebied met een tweede verwarming pad en schone kooien met steriele beddengoed. NB: Dit gebied kan ook huis items zoals een kraal sterilisator. 2. poortader Injection Een uur voor de geplande injecties behandelen Balb / c vrouwtjesmuizen leeftijd 8 – 15 weken met 100 gl 0,015 mg / ml buprenorfine, subcutaan, voor pijnbestrijding. Opmerking: Deze injectie protocol kan worden toegepast op elke stam van vrouwelijke of mannelijke muizen op elke leeftijd, met de juistecellijnen voor wijziging van de stam. Bereid de tumorcellen voor injectie op basis van protocollen voor de cellijn of tumor explant keuze. Test alle tumorcellijnen vóór toediening op de aanwezigheid van muizen pathogenen om het risico van invoering van dergelijke pathogenen in het dier kolonie verminderen. Voor syngene Balb / c tumorcellijnen zoals D2A1, D2.OR en 4T1 tumorcellen, dooi cellen in een 10 cm weefselkweekplaat 3 dagen vóór injectie zodat de volgende dag cellen bij ~ 90-100% confluentie. 1 dag na tumorcel ontdooien cellen eenmaal te wassen met 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en trypsinize de confluente tumorcellen middels 2 ml 0,05% trypsine bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Voeg 8 ml compleet medium (DMEM hoog glucose, 10% foetaal runderserum, 2 mM L-glutamine, en 1 x penicilline / streptomycine) en doorgang 1:10 in vers 10 cm schaal met 10 ml van compleet medium. Op de dag van de injectie, was cellen eenmaal met 1x PBS en trypsinize zoals hierboven beschreven. Resuspendeer getrypsiniseerd cellen in 8 ml compleet medium, centrifugeren gedurende 5 min bij 1500 xg, verwijder de media en hersuspenderen in 5 ml 1x PBS. Tellen cellen op een hemocytometer met behulp van trypan blauw uitsluiting voor de levensvatbaarheid van de beoordeling. Resuspendeer cellen voor injectie in 1x PBS bij een vooraf bepaalde concentratie en volume. OPMERKING: 5-10 gl wordt aanbevolen als kleinere injectievolume onnodige schade aan de lever te voorkomen. Houd cellen op ijs voor de duur van de injecties. Na voltooiing van injecties terug een monster van cellen aan het laboratorium en plaats aan cultuur in compleet medium gedurende 1 dag levensvatbaarheid te garanderen. Plaats de muis onder verdoving met 2-2,5% isofluraan (2-chloor-2- (difluormethoxy) -1,1,1-trifluor-ethaan) geleverd in zuurstof. Handhaaf de lichaamstemperatuur met behulp van de verwarming pad. Zorgen voor volledige verdoving door het beoordelen van een reactie op een teen knijpen en daarna te onderhouden anestheSIA: 2 – 2,5% isofluraan. LET OP: Het is belangrijk om de dieren ademhaling te controleren en pas de isofluraan debiet tijdens de gehele procedure. Plaats een kleine hoeveelheid kunsttranen of dierenarts zalf op elk oog om uitdroging van het oog tijdens de operatie te voorkomen. Plaats de muis in liggende positie op zijn rug met buik blootgesteld. Verwijderen van haar op de ventrale linkerkant van het knaagdier van de tweede rib ruimte naar de 4 e inguinale borstklier tepel door wrijven met ontharingscrème. Laat de ontharingscrème te zitten voor 1-2 minuten en daarna volledig te verwijderen met een gaasje en H 2 O. Deze stap kan worden gedaan 1-2 dagen van tevoren om tijd te besparen als tal van operaties worden gepland. Neem een ​​2 x 2 "steriel gaasje spons (gedrenkt in 2% chloorhexidine) en veeg de muisknop op de site van ontharing. Steriliseer de hele omgeving, met inbegrip van de staart, bacteriële cont minimaliserenaminering van instrumenten. Veeg de site van ontharing en omgeving neer met een alcohol prep pad. Herhaal 2% chloorhexidine en alcohol stappen nog een keer en sluit af met een laatste chloorhexidine veeg naar beneden voor een totaal van drie 2% chloorhexidine en twee alcohol prep pad wasbeurten. Laat de laatste chloorhexidine vegen, zodat de chemische stof die niet druipt rond de chirurgische plaats te krijgen van chloorhexidine op interne organen te voorkomen. OPMERKING: De toepassing van grote hoeveelheden chloorhexidine en alcohol aan de huid en omringende vacht kan leiden tot een aanzienlijke daling van de lichaamstemperatuur. Veeg niet met een overmaat volume tijdens stappen 2,7-2,9. Handhaving van de lichaamstemperatuur met een verwarmingselement. Met steriele handschoenen en een steriele scalpel met steriel mes, maak een 1-inch incisie in de huid tussen de mediaan en Sagittaal aan de linkerzijde van de muis, beginnend net onder de ribben en eindigt net boven het vlak van de vierde inguinale borstklier speen. Gebruik geautoclaveerd of korrels gesteriliseerd schaar en forceps, maak eenzelfde 1-inch insnijding in het peritoneum. Vermijd het snijden in het uiervet pad en zorgen voor de darmen, lever, of het middenrif niet te snijden. Plaats een 4 x 4 "gaasje gedrenkt in steriele zoutoplossing aan de linkerkant van de muis, waarbij de incisie gemaakt, zodat interne organen op het gaas kunnen worden gebracht en niet in contact met de omringende huid of operatiegebied komen. Bereid tumorcellen door en neer te pipetteren meerdere malen tumorcellen zal regelen tijdens de bereiding van de muis. Bereid een 25 ul verwisselbare naald spuit en 32-gauge naald met tumorcellen. Druk op de spuit totdat tumorcellen aan het uiteinde van de naald en de zuiger aan het juiste volume voor injectie; vermijden injectie van luchtbellen. Veeg de buitenkant van de naald met een steriele alcohol pad naar een externe tumorcellen te verwijderen. Wees voorzichtig om naaldprikken te voorkomen. Houd de mediaan side van de incisie, met inbegrip van huid en peritoneale voering, opzij met de tang en een steriele wattenstaafje trek de grote en kleine darm uit, die hen in de steriele gaasje gedrenkt in steriele zoutoplossing. Trek de grote en kleine darm totdat de poortader wordt gevisualiseerd. Bedek de inwendige organen in de zoutoplossing gedrenkt gaas inwendig beslaan en steriliteit te behouden. Laat een helper, ook het dragen van steriele handschoenen, houdt de darmen gewikkeld in de zoutoplossing gedrenkt gaas voorzichtig uit de weg met een steriel wattenstaafje om volledig te onthullen de poortader. Bovendien kan het nodig zijn de geautoclaveerde hemostaat of tang om weefsels opzij houden de mediaan zijde van de incisie. Steek de naald geladen met tumorcellen ~ 3-5 mm in de poortader ~ 10 mm onder de lever onder een hoek <5 ° om de ader, met een schuine naar boven. Injecteer langzaam de volledige volume met tumorcellen. Laat bloed voorbij de naald h stromenead enkele seconden ingedrukt om terug te voorkomen dat stroom van tumorcellen uit de ader. Minimaliseren verplaatsen van de naald in de ader tijdens de injectie. Nogmaals, wees voorzichtig om naaldprikken te voorkomen. LET OP: Visualisatie van de poortader wordt gedaan zonder vergroting, maar een stereo-microscoop kan worden gebruikt indien gewenst. Verwijder de naald, terwijl tegelijkertijd een steriele katoenen tip applicator het in de ader onder druk. Met de assistent nog steeds de darmen houdt opzij zet een stuk van 0,5-1 cm 2 hemostatische gaasje op de injectieplaats op de ader. LET OP: Hemostatische poeder werd ook geprobeerd voor deze stap in het protocol, maar was niet effectief in het stoppen van veneuze bloedverlies na de injectie. Houd de hemostatische gaasje op de injectieplaats met de druk van een steriele katoenen tip applicator gedurende 5 minuten. Beoordelen afsluiting van de ader door voorzichtig optillen van de hemostatische gaas, indien het gaas kleeft aan het omringende weefsel, een kleine hoeveelheid sterile zoutoplossing kan worden gebruikt om te genieten en til het gaas. Als bloedverlies optreedt op dit moment, plaatsen van een extra stuk hemostatische gaasje ter plaatse onder druk gedurende nog 5 min. Wanneer de bloedstroom helemaal is gestopt, verwijder het gaas van de muis. LET OP: bloedverlies tijdens de chirurgische procedure moet zorgvuldig worden beoordeeld en als de totale toegestane bloedverlies volume wordt bereikt of overschreden (op basis van de regelgeving standard operating procedures voor de onderzoeker institutionele review boards) de muis moet, terwijl onder verdoving door cardiale perfusie worden gedood. Zodra de injectieplaats intact geacht, zonder bloed verlaat de injectieplaats, plaats de inwendige organen zachtjes heen in de buikholte. Hecht de peritoneale bekleding en vervolgens de huid met steriele 4-0 Vicryl hechtdraad en spitse naald met behulp van een eenvoudige continue of onderbroken hechtdraad patroon. Gewoonlijk sluiten van de incisie vereist 10-15 hechtingen. Injecteer 100 ul Bupivacaine (5 mg / ml) langs de incisie plaatselijke pijn met een insulinespuit. Injecteer 0,5 ml steriele zoutoplossing subcutaan met behulp van een 1 ml spuit met een 26-gauge naald voor hydratatie. Operaties nemen 15 – 25 minuten in beslag. Om steriele omstandigheden te handhaven gedurende de operatie, zodat alle gereedschappen en materialen in contact met de muis, zoals handschoenen, schoongemaakt geschikte voorafgaand aan contact. Waar mogelijk gebruik steriele materialen en handschoenen, of minimaal gebruik van een 70% ethanol-oplossing of 10% bleekwater oplossing schoon te maken. Als er meerdere operaties worden gepland voor een enkele sessie remake van de eerste chirurgische gebied met verse steriel laken, insuline spuiten, 1 ml spuiten, steriele zoutoplossing, 2 x 2 "steriel gaasje sponzen, 4 x 4" steriel gaasje, hemostatische gaas snijd ze in 0,5 – 1 cm 2 stuks, 4-0 Vicryl hechtingen met conische naald en 2% chloorhexidine. Bead-steriliseren van de schaar, pincet en hemostat tussen operaties en laatom adequaat te koelen voorafgaand aan hergebruik. 3. Recovery, Monitoring knaagdier Gezondheid en End-point Analyses Nadat de chirurgische procedure voltooid is, houden muizen op een verwarmingselement voor herstel beddengoed-vrije, schone kooien voor een minimum van 20 min. Muizen nemen meestal 2-4 min te ontwaken uit narcose. Heeft een dier dat een operatie om samenleven met andere dieren heeft ondergaan totdat deze volledig is hersteld van de anesthesie niet meer terug. Heeft een dier niet onbeheerd achter te laten terwijl hij weer bij bewustzijn en controleren totdat het dier de mogelijkheid om zich in borstligging behouden heeft herwonnen. Geef muizen 0,05-0,1 mg / kg buprenorfine voor pijnbestrijding elke 6-12 uur na een operatie, maximaal 72 uur. Controleer hechtingen dagelijks om ervoor te zorgen dat ze intact blijven tijdens de genezing. In het geval dat de hechtingen komen ongedaan gemaakt, plaatst u de muis onder verdoving, verwijder de resterende hechtingen, en vervangen. Bij infectie of Inflammatie raadplegen dierenarts personeel. LET OP: Infectie of ontsteking is nog niet ondervonden met dit protocol. Voor metastase studies, het uitvoeren van dagelijkse gezondheidscontroles tot uiterlijke tekenen van gemetastaseerde ziekte worden waargenomen, waaronder, maar niet beperkt tot:> 10% gewichtsverlies / winst, scruffiness, verlies van aandacht voor de omgeving, de buik oedeem / ascites, lichte ogen en oren, of een gebogen positie. OPMERKING: Dagelijkse gezondheid controle van groot belang bij het ontwikkelen van een model voor een nieuwe cellijn of celconcentratie tot de tijdlijn van metastase goed begrepen. Op studie eindpunt, euthanaseren muizen door CO 2 inhalatie, gevolgd door cervicale dislocatie. LET OP: Alternatieve methoden voor euthanasie door commissie van toezicht van de onderzoekers zijn goedgekeurd mogen worden gebruikt, met inbegrip van perfusie met 1x PBS terwijl onder verdoving. Perfusie van de lever wordt uitgevoerd door cannuleren de poortader, knippen de onderste vena cava, en duwen 1x PBS thruwe de lever vaatstelsel met een snelheid van 4 ml / min gedurende 1-2 min verwijderen circulerende bloed en leukocyten. Opmerking: Afhankelijk van het eindpunt van de studie, de cellijn en de gebruikte concentratie, openlijke levermetastasen dan niet duidelijk zijn bij autopsie. Micrometastasen laesies kunnen worden onthuld met histologische analyse van de lever. Eindpunten zal variëren op basis van de onderzoeksopzet. Extraheer de lever met schaar en forceps door eerst de galblaas verwijderen, vervolgens dwars door de onderste vena cava superior naar de lever. Knip de vena cava, de poortader en leverslagader inferieur aan de lever. Verwijder de gehele lever voorzichtig wassen in 5x 1x PBS. Scheid de lever naar links, rechts, de mediaan, en caudatus lobben. Formaline fix lever in 10% neutraal gebufferde formaline gedurende 48 uur onder schudden bij kamertemperatuur. Werkwijze weefsels door een reeks alcoholen toenemende concentratie en xyleen; paraffine insluiten de vaste weefsel 71 </sup>. LET OP: Als alternatief kan de lever kan worden snap-bevroren door het plaatsen van weefsel in een cryomold met optimale snij-temperatuur (LGO) formule en het bevriezen op droog ijs pellets ondergedompeld in 95% ethanol. Met behulp van een microtoom, snijd ze in de paraffine ingebed weefsel blok zodanig dat een match-grootte van het hoofd van het weefsel wordt onthuld. Snijd vijf 4-micron seriecoupes, dit vormt het eerste niveau voor analyse. Snijd de 250 micron weefsel, gooi deze secties in het afval. Bij 250 micrometer gesneden een tweede niveau van vijf 4-micron opeenvolgende coupes. Herhaal noodzakelijk doorsnede door de gehele lever. Hematoxyline en eosine vlek het eerste gedeelte van elk niveau om te beoordelen voor metastase 72. LET OP: Voor snap-ingevroren weefsel gebruik van een cryostaat secties te snijden. OPMERKING: Detectie van micrometastatische ziekte tumorcel specifieke kleuring vereist. Verwijder muizen uit onderzoek als er tumorgroei bij de incisie zittene, aangezien dit aangeeft tumorcel lekkage in de buikholte na injectie. OPMERKING: Dit probleem is niet waargenomen.

Representative Results

De poortader injectiemodel, waarbij tumorcellen direct worden geleverd aan de lever via een chirurgische ingreep, maakt tumorcel injectie in de poortader. Onder antiseptische omstandigheden, in een verdoofde muis, ~ 1-inch chirurgische incisie gemaakt aan de linkerzijde van de muis tussen de mediaan en Sagittaal vanaf net boven het vlak van de vierde inguinale borstklier speen en eindigend net onder de ribben . De grote en kleine darm worden voorzichtig getrokken door de incisie visualisatie van de poortader (Figuur 1A) verschaffen. Accurate anatomische identificatie van de poortader en succesvolle intra-portal injectie kan worden bevestigd door het beoefenen van de injectieprotocol met Indische inkt of soortgelijke kleurstof. Juiste injectie via de poortader resulteert in de inkt wordt direct en specifiek afgeleverd aan de lever, en niet tot in India inkt verspreid naar de longen (Figure 1B). Verder gebruik D2A1 muizenborsttumorvirus cellen gelabeld met GFP, verspreiding van tumorcellen gehele lever blijkt negentig minuten na injectie, bevestigt poortader injectie afgifte aan de lever (Figuur 1C). Bij hogere vergroting blijkt dat op 90 min na injectie, tumorcellen binnen sinusoïden, alsmede in de lever parenchym in de nabijheid portal triaden, waarbij de poortader bloed in de lever (Figuur 1C). Deze gegevens suggereren dat actieve tumorcel extravasatie optreedt op 90 min na injectie van tumorcellen. Samengenomen geven deze gegevens bevestigen dat de poortader injectiemodel levert het injectievolume direct naar de lever, met inkt of tumorcellen gedispergeerd door de lever en geen merkbare transport van injectievolume aan de long. Om de robuustheid van de poortader injectie model te beoordelen, drie SEPARat syngene muizen mammaire tumorcellijnen werden getest in volwassen vrouwelijke Balb / c muizen. Deze borsttumor lijnen werden geselecteerd op basis van hun gedrag gekenmerkt in uiervet pad modellen en omvatten de zeer agressieve en metastatische 4T1 cellijn, de minder agressieve metastatische D2A1 lijn, en de lage / niet-uitgezaaide D2.OR lijn 37,61,73 , 74. 2.000 en 10.000 cellen per injectie werden getest met geen noemenswaardige verschillen in de tijd tot de ontwikkeling van openlijke metastase met deze lage concentraties cel. Voor deze studies surrogaat markers van metastase werden gebruikt zoals gebrek aan verzorging, bleekheid en gewichtsverlies necropsie, waarna de aanwezigheid of afwezigheid van levermetastasen werden bevestigd door visuele beoordeling van de lever en andere organen binnen het portaal bevestigen levering rechtvaardigen . Deze gegevens bevestigen eerdere berichten dat de 4T1 en D2A1 cellijnen vertegenwoordigen meer agressieve borsttumor lijnen, kortere metastase vrije overleving tarieven zijn waargenomen in vergelijking met muizen geïnjecteerdmet de minder agressieve D2.OR lijn (Figuur 2A). Muizen geïnjecteerd met 4T1 of D2A1 tumorcellen ontwikkeld openlijke levermetastasen van ~ 30 – 40 dagen na injectie, en sommige ontwikkelde metastase al op 18 dagen na de injectie (Figuur 2A), terwijl slechts één muis geïnjecteerd met cellen hadden D2.OR ontwikkelde openlijke lever metastase door studie einde, die 60-65 dagen na de injectie van tumorcellen. Metastasen werden vervolgens bevestigd door snijden door de lever bij 250 urn niveaus en analyseren hematoxyline en eosine (H & E) gekleurde secties (Figuur 2B-D). Naast openlijke detectie van metastatische lesies in de muizenlever, kan de poortader model ook worden gebruikt om eerdere gebeurtenissen in de metastatische cascade waaronder detectie van enkelvoudige cellen / celclusters volgende extravasatie en vorming van micro-metastasen bestuderen. Multiplex immunofluorescentie-kleuring werd gebruiktnaar 4T1, D2A1 en D2.OR mammaire tumorcellen te detecteren in lever wanneer zij aanwezig zijn als enkele cellen of micro-metastasen zijn, H & E is niet voldoende om de aanwezigheid van kleine laesies bevestigen. Figuur 3A toont een representatieve Balb / c muis lever met een vermeend micrometastasen brandpunten van D2A1 tumorcellen die positief zijn voor de epitheliale keratine CK18, negatief voor de pan-immune marker CD45, en negatief voor de hepatocyt marker Heppar-1 zijn. Hepatocyten ook positieve vlek voor CK18, noodzakelijk gebruik van Heppar-1 in deze vlekken panel. Een belangrijke opmerking is dat galkanaalepitheel en progenitorcellen vlek positief voor CK18, waardoor zorgvuldige onderscheid tussen tumorcellen en galwegen, met name bij de beoordeling periportale regio (Figuur 3A). Een alternatief voor multiplex immunofluorescentie om enkele verspreide cellen en micrometastasen brandpunten identificeren is om syngene borsttumor lijnen getagd met verbeterde groen fluorescerend gebruikeneiwit (eGFP) en / of luciferase en het uitvoeren van IHC voor de tag (figuur 1C). Door de immunogeniciteit van eGFP, luciferase, en andere eiwitten, is het essentieel om muismodellen die tolerant tegen deze proteïnen, zoals de nieuwe immuuncompetente "glowing head" muis die eGFP expressie brengt en luciferase in de hypofyse 75 gebruiken. Voor de identificatie van macrometastatic laesies van niet-gelabelde syngene lijnen zoals de D2A1 tumor lijn, de CK18 / Heppar-1 / CD45 multiplex immunofluorescentie is ideaal (Figuur 3B). Figuur 1: de poortader Injection Levert Tumor cellen direct naar de lever. A) poortader injectie; de incisie wordt gemaakt tussen de mediaan en linker Sagittaal, van boven het vlak van de vierde inguinale borstklier speen en eindigend net onder de rib kooi. B) Balb / c lever met PBS injectie (links). Naar aanleiding van Oost-Indische inkt injectie via de poortader, de lever (midden), maar niet de long (rechts) neemt inkt. C) Representatieve dunne deel beelden van D2A1 muizenmelkkliertumorvirus cellen gelabeld met GFP in een Balb / c-muis lever op 90 min na injectie van 1 x 10 6 tumorcellen via de poortader. Levers werden formaline gefixeerd, in paraffine ingebed, in secties verdeeld en gekleurd met anti-GFP antilichaam voor detectie van tumorcellen. Top paneel toont donkerbruin gekleurde tumorcellen (pijlen) verspreid over de lever, asterisk geeft niet-specifieke hepatocyte kleuring rond de centrale aderen; schaal bar = 300 micrometer. Onderste panelen tonen representatieve beelden van tumorcellen op 90 min na injectie blijft sterk geassocieerd met vaatstelsel; schaal bar = 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. <pclass = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> Figuur 2: uitgroei van de muis borsttumor cellijnen in de lever poortader Injection. A) Kaplan-Meier curve toont metastase-vrije overleving in muizen geïnjecteerd met 2,000-10,000 4T1, D2A1 of D2.OR muis borsttumor cellen. Muizen werden geïnjecteerd met tumorcellen en gecontroleerd op tekenen van metastase zoals gebrek aan verzorging, lichte ogen, en het gewicht verandert. Metastase werd bevestigd op het moment van de autopsie en door H & E op histologische secties van de levers. N = 2 2000 4T1-cellen; 2 10.000 4T1 cellen. N = 2 D2A1 2000 cellen; 3 D2A1 10.000 cellen. N = 3 D2.OR 2000 cellen; 3 D2.OR 10.000 cellen. Representatieve HE-afbeeldingen B) 4T1 lesies 21 dagen na de injectie van 10.000 cellen, C) D2A1 lesies op 26 dagen na de injectie van 10.000 tumorcellen en D) D2.OR laesies bij59 dagen na injectie van 10.000 cellen; schaalbalken = 75 pm. Soortgelijke laesies worden waargenomen wanneer 2000 4T1 of D2A1 tumorcellen werden geïnjecteerd. Geen laesies werden gedetecteerd met 2000 D2.OR cellen. Geen bewijs van metastasen in andere organen of de chirurgische incisie bleek in elke muis in deze studies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Detectie van enkele cellen en metastatische laesies in de muis lever met behulp van Multiplex Immunofluorescentie. A) Vertegenwoordiger multiplex immunofluorescentie van D2A1 tumorcellen in een Balb / c-muis lever op 90 min na injectie met behulp van de poortader injectie model. Kleuring werd uitgevoerd met een multiplex kit. Van links naar rechts toont DAPI; CD45 om leukocyten te markeren; Heppar-1 tot mark hepatocyten; en CK18 tumorcellen, hepatocyten en galkanaalepitheel markeren. Samengevoegde afbeelding toont een vermeend cluster van CK18 + Heppar-1 – CD45 – D2A1 tumorcellen nauw verbonden met een portaal triade. Arrow = D2A1 tumorcellen, sterretje = galkanaalepitheel; schaal bar = 25 pm. B) Een vertegenwoordiger openlijke D2A1 metastatische laesie met dezelfde kleuring paneel als in A. Tumorcellen zijn CK18 +, terwijl aangrenzende hepatocyten zijn CK18 + Heppar-1 +; schaal bar = 25 pm. Beelden werden gevangen op een microscoop met 20 x 0,8, 40 x 1.3 en 60 x 1.4 doelstellingen en CCD-camera, met behulp van de microscoop software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

De Balb / c muis de poortader injectiemodel maakt de studie van borstkanker laesies in de lever in afwezigheid van storende meerdere organen en metastase in een volledig immuuncompetente gastheer. Ons protocol is een vooruitgang van eerder gepubliceerde chirurgische procedures die toegang tot de poortader voor injectie van tumorcellen mogelijk direct in de lever 16,55,56. Een vooruitgang die we hebben gemaakt is om een aanzienlijke vermindering van het aantal geïnjecteerde tumorcellen uit ≥ 1 x 10 5 cellen / injectie 16,55,56 naar beneden tot 10.000 tumorcellen / injectie ≤. Ook hebben wij in het model voor de studie van borstkanker metastase naar de lever. Met behulp van dit protocol, twee borstkanker cellijnen met bekende metastatische potentieel te ontwikkelen levermetastasen met een kortere wachttijd dan een rustende borsttumor cellijn. Ook moeten in vroege tijdstippen, tumorcellen worden verdeeld over de leverparenchym als enkele of kleine groepen van afzonderlijke cells na injectie van tumorcellen. Het model is klaar om vragen van metastatische efficiëntie, met inbegrip van tumorcellen extravasatie, overleving cel, latentie, en proliferatie aan te pakken – allemaal fenotypes die bijdragen aan de ontwikkeling van micro-uitgezaaide en openlijke metastatische ziekte in de lever.

Het is belangrijk om verschillende aspecten van de poortader injectieprotocol voordat wordt begonnen studies onderzocht. Zorgvuldig beslissen over cellijnen, cel concentratie, totaal aantal cellen en eindpunten van belang op basis van kleinere verkennende studies wordt sterk aanbevolen. Verder is het gebruik van immunocompetente syngene gastheer en cellijnen van het grootste belang voor het begrijpen van gastheer-tumor cel interacties. De nieuw ontwikkelde "gloeiende head" muis die uitdrukt eGFP en luciferase uit de hypofyse is een belangrijk instrument voor het elimineren van gastheer reacties op exogene eGFP en luciferase, eiwitten vaak gebruikt om borsttumor lijnen 75 taggen </sup>. Gebruik van de "gloeiende head" muis en syngene tag tumorcellen zal gemakkelijke identificatie van enkele verspreide cellen en micrometastasen foci door IHC vergemakkelijken, zonder de zorg van inflammatoire reacties op eGFP of luciferase. Ook de keuze van pijnbestrijding strategieën zorgvuldig minimale anti- of pro-tumor effect van de behandeling met geneesmiddelen regime te garanderen wordt sterk aanbevolen. Kritische stappen in dit protocol zijn onder meer het handhaven van steriele omstandigheden gedurende operaties aan die infectie doet zich niet te verzekeren, omdat deze resultaten zal beschamen. Het is ook belangrijk dat de naald goed in de vena porta wordt geplaatst zodat tumorcellen naar de lever worden afgeleverd. Het beoefenen van het protocol met kleurstoffen zoals Oost-Indische inkt zal helpen met dit probleem. Tumorgroei in de huid incisie site is de beste indicator die onjuiste plaatsing van de naald zich heeft voorgedaan. Tenslotte is het essentieel dat bloedverlies uit de poortader onvoldoende wordt beheerst en helemaal stopt voordat suturing het dier. Het gebruik van hemostatische gaas vermindert sterk het risico van ongecontroleerd bloedverlies uit de poortader na de injectie. In onze handen, procedurele mortaliteit door bloedverlies uit de poortader na injectie werd verlaagd van 30% tot 2% van muizen met het gebruik van hemostatische gaas.

Het is belangrijk op te merken dat de poortader injectiemodel volledige metastatische cascade niet repliceren, maar is beperkt tot de studie van extravasatie tumorcel, tumorcel-niche interacties bij extravasatie en tumorgroei. Modellen die nauwkeurig te repliceren het volledige metastatische cascade aan de lever, zoals optreedt bij patiënten, zijn dringend nodig. Een extra beperking van de poortader injectie model is dat het wordt verstoord door het effect van de operatie op de host, wondgenezing bekend effect ziekteprogressie 76,77.

De poortader injectie model betekent een verbetering ten opzichte van andere injectiemodellen aan de lever metastase, met inbegrip van intracardiale en milt modellen te bestuderen. Met name de poortader injectiemodel maakt voor de studie van een grotere reeks ziekteprogressie dan intracardiale model, die vaak beperkt door gelijktijdige uitzaaiingen in andere weefsels. Verder wordt de poortader model niet gecompliceerd door verwijdering van de milt, zoals in de milt model.

De poortader injectie model kan een nuttig instrument voor de studie van de lever metastase in het algemeen te bewijzen. Levermetastasen is de meest voorkomende plaats van metastase in adenocarcinomen algemeen met de hoogste cijfers in pancreatische kankers (85% van metastasen naar de lever), colon- en rectale adenocarcinomen (> 70%), en maag en slokdarm (> 30 %) 1. Hoewel spontane en orthotope primaire tumor modellen van de alvleesklier en colon adenocarcinomen gemakkelijker uitzaaien naar de lever 78,79, kan de poortader injectie model prove nuttig voor het begrijpen van de metastatische proces van deze vormen van kanker zoals gecontroleerde aflevering van tumorcellen maakt biochemische, moleculaire en histologische evaluaties op gezette tijden na tumorcel aankomst. Samengevat, de poortader injectiemodel een belangrijke verbetering van beschikbare levermetastasen modellen van borstkanker en kan eveneens gelden voor het levermetastasen in het algemeen.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge Alexandra Quackenbush for assisting with surgical procedures during filming of the video protocol, Hadley Holden for histological support, Sonali Jindal for input on tumor and liver pathology during method development, and Breanna Caruso for critical review of the manuscript. The D2A1 and D2.OR mammary tumor cells were a gift from Dr. Ann Chambers, the D2A1-GFP tumor cells were a gift from Dr. Jeffrey Green, and the 4T1 tumor cells were a gift from Dr. Heide Ford. The OHSU Advanced Light Microscopy Core at the Jungers Center was utilized for imaging. The work included in this manuscript includes funding from NIH/NCI NRSA F31CA186524 (to ETG) and NIH/NCI 5R01CA169175 (to PS).

Materials

1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle BD Syringe 309597 For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp
Alcohol Prep Pads Fisher Scientific 06-669-62 For cleaning of abdomen prior to surgical incision
All Purpose Sponges, Sterile Kendall 8044 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery
Artificial Tears Rugby 370114 Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery
Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml Mfg. by Reckitt Benckiser NDC-12496-0757-1 Use at 0.05 – 0.1 mg/kg body weight, 1-2x daily for 72 hours, injected subcutaneously
Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) Mfg. by Humira Inc NDC-04091163-01 Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 ul injected subcutaneously at incision site 
anti-CD45 antibody BD Pharmingen 550539 Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci
Celox™ Rapid Hemostatic Gauze Medtrade Products Ltd. FG08839011 Cut into 5mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection
Chemical Depilatory Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers
Chlorhexidine, 2% Solution Vet One 1CHL008 Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse
anti-CK18 antibody Abcam ab53118 Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci
Cotton Tipped Applicators, Sterile Fisher Scientific 23-400-114 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope
DMEM, High-Glucose HyClone SH30243.01 Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines
Dry Glass Bead Sterilizer Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers
Ethanol, 70% solution Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers
Fetal Bovine Serum HyClone SH30071.03 Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose
Gauze, Sterile Kendall 2146 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision
anti-Green Fluorescent Protein antibody Vector Laboratories BA0702 Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines
L-Glutamine 200 mM (100X) Gibco 25030-081 Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose
Heating Pad, x2-3 Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers
Hemocytometer Hausser Scientific 1483 For use in cell culture to count cells
Hemostatic Forceps Stainless steel; multiple suppliers
anti-Heppar-1 antibody Dako M7158 Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci
Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge BD   324702 For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp
Isoflurane Piramal NDC-66794-017-25 Administered at 2.5%
Isoflurane Vaporizer VetEquip 911103 Use caution, vaporizes anesthetic gases
Light Source Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers
Neutral buffered formalin, 10% Anatech Ltd. 135 Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology
Opal™ 4-color fIHC kit PerkinElmer, Inc. NEL794001KT Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver
Operating Scissors Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers
Penicillin/Streptomycin, 100x Corning 30-002-Cl Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose
Phosphate-buffered Saline Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers
Removable Needle Syringe, 25 ul, Model 1702 Hamilton 7654-01 For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached
Scalpel handle Stainless steel; multiple suppliers
Scalpel blade, #15 Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers
Small Hub Removable Needles, 32-gauge Hamilton 7803-04 For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12°angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp
Sodium Hypochlorite Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers
Sterile Saline Fisher Scientific BP358-212 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered
Surgical Gloves, Sterile Multiple suppliers
Sutures, Sterile  Ethicon J310H 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp
Table Top Portable Anesthesia Machine VetEquip 901801 Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia
Thumb Dressing Forceps Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers
Towel Drapes, Sterile  Dynarex 4410 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery
Trypan Blue Life Technologies T10282 For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS
Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) Gibco 25300-054 Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  2. Berman, A. T., Thukral, A. D., Hwang, W. T., Solin, L. J., Vapiwala, N. Incidence and patterns of distant metastases for patients with early-stage breast cancer after breast conservation treatment. Clin Breast Cancer. 13, 88-94 (2013).
  3. Savci-Heijink, C. D., et al. Retrospective analysis of metastatic behaviour of breast cancer subtypes. Breast Cancer Res Treat. 150, 547-557 (2015).
  4. Gerratana, L., et al. Pattern of metastasis and outcome in patients with breast cancer. Clin Exp Metastasis. 32, 125-133 (2015).
  5. Bonotto, M., et al. Measures of outcome in metastatic breast cancer: insights from a real-world scenario. Oncologist. 19, 608-615 (2014).
  6. Wyld, L., et al. Prognostic factors for patients with hepatic metastases from breast cancer. Br J Cancer. 89, 284-290 (2003).
  7. Tarhan, M. O., et al. The clinicopathological evaluation of the breast cancer patients with brain metastases: predictors of survival. Clin Exp Metastasis. 30, 201-213 (2013).
  8. Tseng, L. M., et al. Distant metastasis in triple-negative breast cancer. Neoplasma. 60, 290-294 (2013).
  9. Liu, X. H., Man, Y. N., Cao, R., Liu, C., Wu, X. Z. Individualized chemotherapy based on organ selectivity: a retrospective study of vinorelbine and capecitabine for patients with metastatic breast cancer. Curr Med Res Opin. 30, 1017-1024 (2014).
  10. Ahn, S. G., et al. Prognostic factors for patients with bone-only metastasis in breast cancer. Yonsei medical journal. 54, 1168-1177 (2013).
  11. Purushotham, A., et al. Age at diagnosis and distant metastasis in breast cancer–a surprising inverse relationship. Eur J Cancer. 50, 1697-1705 (2014).
  12. Karimi, A., Delpisheh, A., Sayehmiri, K., Saboori, H., Rahimi, E. Predictive factors of survival time of breast cancer in kurdistan province of Iran between 2006-2014: a cox regression approach. Asian Pac J Cancer Prev. 15, 8483-8488 (2014).
  13. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  14. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature reviews. Cancer. 4, 448-456 (2004).
  15. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  16. Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am J Pathol. 153, 865-873 (1998).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, 2541-2546 (2000).
  18. Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9, 285-293 (2009).
  19. Oskarsson, T., et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nat Med. 17, 867-874 (2011).
  20. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17, 816-826 (2015).
  21. Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
  22. Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
  23. Zhao, L., et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1 mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis. Hepatology. 57, 829-839 (2013).
  24. Peinado, H., Lavotshkin, S., Lyden, D. The secreted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thoughts. Semin Cancer Biol. 21, 139-146 (2011).
  25. Van den Eynden, G. G., et al. The multifaceted role of the microenvironment in liver metastasis: biology and clinical implications. Cancer Res. 73, 2031-2043 (2013).
  26. Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3, 537-549 (2003).
  27. Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
  28. Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
  29. Ogba, N., et al. Luminal breast cancer metastases and tumor arousal from dormancy are promoted by direct actions of estradiol and progesterone on the malignant cells. Breast cancer research : BCR. 16, 489 (2014).
  30. Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing gammadelta T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522, 345-348 (2015).
  31. Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nat Rev Immunol. 15, 73-86 (2015).
  32. Zhang, Q., et al. CCL5-Mediated Th2 Immune Polarization Promotes Metastasis in Luminal Breast Cancer. Cancer Res. 75, 4312-4321 (2015).
  33. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27, 462-472 (2015).
  34. Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
  35. Quail, D. F., et al. The tumor microenvironment underlies acquired resistance to CSF-1R inhibition in gliomas. Science. 352, (2016).
  36. Dexter, D. L., et al. Heterogeneity of tumor cells from a single mouse mammary tumor. Cancer Res. 38, 3174-3181 (1978).
  37. Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
  38. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
  39. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998).
  40. Doornebal, C. W., et al. A preclinical mouse model of invasive lobular breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 353-363 (2013).
  41. Derksen, P. W., et al. Somatic inactivation of E-cadherin and p53 in mice leads to metastatic lobular mammary carcinoma through induction of anoikis resistance and angiogenesis. Cancer Cell. 10, 437-449 (2006).
  42. Pravtcheva, D. D., Wise, T. L. Metastasizing mammary carcinomas in H19 enhancers-Igf2 transgenic mice. J Exp Zool. 281, 43-57 (1998).
  43. Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
  44. Basse, P., Hokland, P., Heron, I., Hokland, M. Fate of tumor cells injected into left ventricle of heart in BALB/c mice: role of natural killer cells. J Natl Cancer Inst. 80, 657-665 (1988).
  45. Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. , e4260 (2012).
  46. Balathasan, L., Beech, J. S., Muschel, R. J. Ultrasonography-guided intracardiac injection: an improvement for quantitative brain colonization assays. The American journal of pathology. 183, 26-34 (2013).
  47. Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51, 868-881 (2014).
  48. Zhou, H., Zhao, D. Ultrasound imaging-guided intracardiac injection to develop a mouse model of breast cancer brain metastases followed by longitudinal MRI. J Vis Exp. , (2014).
  49. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J Vis Exp. , (2010).
  50. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. , e51677 (2014).
  51. Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med. 204, 3037-3047 (2007).
  52. Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
  53. Levy, L., et al. Splenectomy inhibits non-small cell lung cancer growth by modulating anti-tumor adaptive and innate immune response. Oncoimmunology. 4, e998469 (2015).
  54. Higashijima, J., et al. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice. Anticancer Res. 29, 385-393 (2009).
  55. Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
  56. Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G682-G688 (2016).
  57. Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17, 163-170 (1999).
  58. Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., Coligan, J. E. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. , (2001).
  59. Mahoney, K. H., Miller, B. E., Heppner, G. H. FACS quantitation of leucine aminopeptidase and acid phosphatase on tumor-associated macrophages from metastatic and nonmetastatic mouse mammary tumors. J Leukoc Biol. 38, 573-585 (1985).
  60. Rak, J. W., McEachern, D., Miller, F. R. Sequential alteration of peanut agglutinin binding-glycoprotein expression during progression of murine mammary neoplasia. Br J Cancer. 65, 641-648 (1992).
  61. Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
  62. Lyons, T. R., et al. Postpartum mammary gland involution drives progression of ductal carcinoma in situ through collagen and COX-2. Nat Med. 17, 1109-1115 (2011).
  63. Allott, E. H., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drug use, hormone receptor status, and breast cancer-specific mortality in the Carolina Breast Cancer Study. Breast Cancer Res Treat. 147, 415-421 (2014).
  64. Kim, S., et al. Lifetime use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast cancer risk: results from a prospective study of women with a sister with breast cancer. BMC Cancer. 15, 960 (2015).
  65. Esbona, K., et al. COX-2 modulates mammary tumor progression in response to collagen density. Breast Cancer Res. 18, 35 (2016).
  66. Andrade, R. J., et al. Drug-induced liver injury: an analysis of 461 incidences submitted to the Spanish registry over a 10-year period. Gastroenterology. 129, 512-521 (2005).
  67. Chalasani, N., et al. Causes, clinical features, and outcomes from a prospective study of drug-induced liver injury in the United States. Gastroenterology. 135, 1924-1934 (2008).
  68. O’Brien, J., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs target the pro-tumorigenic extracellular matrix of the postpartum mammary gland. Int J Dev Biol. 55, 745-755 (2011).
  69. Adamson, T. W., et al. Assessment of carprofen and buprenorphine on recovery of mice after surgical removal of the mammary fat pad. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49, 610-616 (2010).
  70. Doornebal, C. W., et al. Morphine does not facilitate breast cancer progression in two preclinical mouse models for human invasive lobular and HER2(+) breast. Pain. 156, 1424-1432 (2015).
  71. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. , (2008).
  72. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. , 655-658 (2014).
  73. Maller, O., et al. Collagen architecture in pregnancy-induced protection from breast cancer. J Cell Sci. 126, 4108-4110 (2013).
  74. Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int J Cancer. , (2014).
  75. Day, C. P., et al. 34;Glowing head" mice: a genetic tool enabling reliable preclinical image-based evaluation of cancers in immunocompetent allografts. PLoS One. 9, (2014).
  76. Schafer, M., Werner, S. Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 628-638 (2008).
  77. Kuraishy, A., Karin, M., Grivennikov, S. I. Tumor promotion via injury- and death-induced inflammation. Immunity. 35, 467-477 (2011).
  78. Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. Mouse models of pancreatic cancer. World J Gastroenterol. 18, 1286-1294 (2012).
  79. Johnson, R. L., Fleet, J. C. Animal models of colorectal cancer. Cancer Metastasis Rev. 32, 39-61 (2013).

Tags

Portal Vein InjectionLiver MetastasisBreast CancerTumor CellsMurine ModelMetastatic CascadeCell ExtravasationCell SeedingCell DeathCell ProliferationCell DormancySurgical ProcedureAnatomical SurveillanceBalb/c MiceAnalgesiaDisinfectionIncisionTumor Cell Injection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. J. Vis. Exp. (118), e54903, doi:10.3791/54903 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image