门静脉注射模型来研究肝转移乳腺癌

本文中的所有动物的程序进行了审查，并在俄勒冈卫生科学大学机构动物护理和使用委员会的批准。 1.手术区及仪器的研制通过高压灭菌器在124℃制备的剪刀，镊子，以及止血30分钟，1 – 前计划手术2天。保证进入蒸压或无菌床上用品，笼具和食品手术后的恢复。 制备无菌手术区，优选在层流罩。 擦拭手术区的所有表面用10％的漂白剂，包括加热垫，光源，麻醉管和鼻锥，以及外科套件，就可以在接近手术过程中的任何其他部分，而正在执行它。 在无菌手术区，放置清洗加热垫无菌的悬垂性，光源，麻醉管和鼻锥，胰岛素注射器1毫升注射器，布比卡因，人工泪液，无菌生理盐水，2×2“无菌纱布海绵，4×4”无菌纱布，止血纱布切成0.5 -为1cm 2片，剪刀，镊子，止血钳，4-0薇乔缝线锥针，并在高压灭菌容器50×2％洗必泰。 确保有空间在该空间用于储存在冰上制备肿瘤细胞。 在邻近手术区的替补，准备与第二加热垫和干净笼子用无菌床上用品的回收区。 注：此区域也可房子件如珠灭菌。 2.门静脉注射一小时前计划打针，治疗的Balb / c小鼠年龄8 – 14周的100微升0.015毫克/毫升丁丙诺啡，皮下，疼痛管理。 注意：此注射方案可在任何年龄使用适当应用到雌性或雄性小鼠的任何菌株细胞系更改到应变。 制备基于所述细胞系或选择的肿瘤外植体协议的肿瘤细胞注射。测试的鼠病原体存在给药前所有的肿瘤细胞系，以减少引入这种病原体到动物菌落的危险性。 对于同基因的Balb / c肿瘤细胞系，包括D2A1，D2.OR，和4T1肿瘤细胞，解冻细胞变成在10cm组织培养板中在注射前3天使得第二天细胞是在约90 – 100％汇合。 1天以下肿瘤细胞解冻洗涤细胞一次用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）和t​​rypsinize使用2毫升0.05％胰蛋白酶的汇合的肿瘤细胞在37℃下5分钟。加入8 ml完全培养基（DMEM高葡萄糖，10％胎牛血清，2mM的L-谷氨酰胺和1x青霉素/链霉素）和通道1:10到一个新的10cm皿用10ml完全培养基中。 在注射当天，洗细胞一次用1×PBS和叔如上所述rypsinize。 胰酶消化重悬细胞的8ml完整的媒体，旋转5分钟，在1500 XG，删除媒体并悬浮在5毫升1X PBS。 指望使用可行性分析台盼蓝排除血球细胞。悬浮用于注射在1×PBS中的细胞以一个预先确定的浓度和体积。 注：5 – 推荐10微升较小的注射量防止肝脏造成不必要的损害。 保持细胞在冰上注射的持续时间。以下注射完成后，在完全培养基返回细胞到实验室的样品，并放置在培养1天，以确保可行性。 放置麻醉下鼠标2 – 中的氧输送2.5％的异氟醚（2-氯-2-（二氟甲氧基）-1,1,1-三氟乙烷）。使用加热垫保持体温。通过评估到脚趾捏的反应确保完全麻醉，然后保持anestheSIA在2 – 2.5％异氟醚。 注：监测呼吸率的动物，并在整个过程相应地调整异氟烷流速是很重要的。 放置人工泪液或兽医软膏少量每只眼上，以避免在手术过程中对眼睛的过度干燥。 鼠标放置在仰卧位置，其与腹部露出背部。 擦拭用化学脱毛剂的区域上的腹侧左侧从第二肋空间啮齿动物的下降到第 4腹股沟乳腺的乳头移除毛发。让脱毛坐1 – 2分钟，然后用纱布和H 2 O.这一步可以做到1完全删除-提前2天，如果众多的手术计划，以节省时间。 需要一个2×2“无菌纱布海绵（2％洗必泰浸泡），在脱毛的部位擦拭鼠标。消毒的整个周边地区，包括尾巴，尽量减少细菌续仪器胺化。 擦拭脱毛的部位及周边地区下用酒精消毒片。 重复2％洗必泰和酒精步骤一次和最后完成洗必泰擦拭下来一共有三个2％洗必泰和两个酒精片洗涤。做最后的洗必泰擦拭，这样的化学品绕不手术部位滴落，避免内脏越来越洗必泰。注意：可能导致体温显著下降的大量氯己定和醇对皮肤和周围毛皮中的应用。不要使用过程中的步骤2.7-2.9过量体积擦拭。保持体温用加热垫。 使用无菌手套，并用无菌刀片无菌手术刀，使一个单一的1英寸切口进入鼠标的左侧的中位数和矢状平面之间的皮肤，开始只是肋下方和刚刚第四腹股沟的平面上方结束乳腺乳头。 使用高压灭菌或消毒珠剪刀和镊子，做一个类似的1英寸的切口进入腹腔。不要切到乳腺脂肪垫，确保不切肠，肝，或隔膜。 放置浸泡在无菌盐水的小鼠，其中该切口制成，例如内脏可以放在纱布和不与周围的皮肤或外科区域接触的左侧4×4“纱布垫。 通过上下吹打数次肿瘤细胞将制备鼠标期间沉降制备肿瘤细胞。制备25μl的可移动针注射器和32号针头与肿瘤细胞。推注射器直至肿瘤细胞是在针的顶端与柱塞是在注射适当的体积;避免气泡的注入。 擦拭针的外面用无菌酒精垫以除去任何外部的肿瘤细胞。请小心，避免扎伤。 按住中间的sid切口，包括皮肤和腹膜衬里，一边用钳子e和使用无菌棉签小心地将大，小肠子出来，将它们放置于灭菌生理盐水浸泡消毒纱布。拉出大肠和小肠，直到门静脉可视化。 盖在盐水浸湿的纱布内脏，保持内部的水分和不育。 有一个助理，还戴无菌手套，轻轻地握裹在盐水浸湿的纱布闪开用消毒棉肠子放倒棉签充分显露门静脉。另外，可能有必要使用蒸压止血钳或钳子到一旁保持组织上的切口的中间侧。 插入装载有肿瘤细胞〜3的针 – 5毫米深处门静脉〜肝脏10毫米以下一角度<5°到静脉，以斜角朝上。缓缓注入含有肿瘤细胞的最大音量。允许血液流过针ħEAD几秒钟，以避免后面的肿瘤细胞的流出静脉。最大限度地减少在注射过程中移动在静脉针。再次，谨慎使用，以免扎伤。 注意：门静脉的可视化是不放大完成，但如果优选的，可以使用立体显微镜。 卸下针，同时放置一个无菌棉签在静脉压力。与助手仍持有肠子一旁放置一块0.5 – 1 平方厘米的止血纱布上静脉注射部位。 注：止血粉也尝试了这一步的协议，但并没有有效阻止以下注射静脉失血。 从无菌棉签5分钟保持在注射部位有压力的止血纱布。 通过仔细地提起止血纱布，如果纱布粘附到周围的组织，与不孕少量评估静脉闭合Ë盐水可以用来浸泡并解除了纱布。 如果此时发生失血，放置在与压力站点止血纱布的附加一块额外5分钟。当血流完全停止，取出鼠标纱布。 注：在手术过程中失血必须仔细评估，如果总让出血量达到或超过（基于研究者的机构审查委员会的监管标准操作程序）鼠标必须同时在心脏灌注麻醉下实施安乐死。 一旦注射部位被视为完整的，没有血液离开注射部位，放置内脏轻轻放回腹腔。 缝合腹膜衬里，然后用简单的连续或间断缝合图案用无菌4-0薇乔缝合和锥形针的皮肤。通常情况下，关闭切口需要缝合10-15。 注入100微升补脾的vacaine（5毫克/毫升）沿使用胰岛素注射器切口部位为局部疼痛管理。用1毫升注射器26号针头水化注入0.5毫升无菌生理盐水皮下。手术需要15 – 25分钟才能完成。 在整个手术保持无菌条件下，确保所有的工具和材料进入鼠标，包括戴手套的手接触，进行清洁以适当联系前。在可能的情况使用的无菌材料和手套，或最低限度利用70％乙醇溶液或10％漂白溶液清洗。 如果多次手术计划为单个会话重拍新鲜无菌的悬垂性，胰岛素注射器1毫升注射器，无菌生理盐水初期手术区，2×2“无菌纱布海绵，4×4”无菌纱布，止血纱布切成0.5 – 为1cm 2片，用锥形针4-0薇乔缝合线，和2％氯己定。珠消毒手术的剪刀，镊子，止血和在并允许到充分冷却前再次使用。 3.恢复，监控鼠类健康和终点分析外科手术完成后，维持在无寝具-，洁净笼回收了至少20分钟的加热垫的小鼠。小鼠通常需要2 – 4分钟从麻醉中醒来。 不要返回已进行手术，同居与其他动物，直到它已完全麻醉中恢复的动物。而它的苏醒不要让动物无人值守和监控，直到动物已经恢复，以保持自己在胸骨斜卧的能力。 给小鼠0.05 – 0.1毫克/千克丁丙诺啡疼痛管理每6-12小时手术后，时间长达72小时。 检查缝合线每天以确保它们愈合过程中保持不变。在这种缝合来撤消的情况下，将鼠标麻醉下，除去剩余的缝线，并更换。在感染或inflamm的情况下通货膨胀请教兽医人员。 注：感染或炎症尚未遇到此协议。 对于转移研究，进行日常健康检查，直至观察到，包括转移性疾病的外在迹象，但不限于：> 10％的重量损失/收益，scruffiness，注意输给周围，腹部水肿/腹水，苍白的眼睛和耳朵，或驼背的位置。 注：开发使用新的细胞系或细胞浓度使用模型时，直到转移的时间轴是很好理解的每日健康检查是特别重要的。 在研究终点，用CO安乐死小鼠吸入2颈椎脱位。 注：由调查“监督委员会的批准安乐死的替代方法可以采用，包括用1×PBS灌注，而麻醉下。肝脏的灌注是通过cannulating门静脉，剪断下腔静脉，并推压1×PBS中第执行粗糙以4毫升/分钟为1的速率的肝脏血管 – 2分钟以除去循环血液和白细胞。 注意：根据端点的研究中，细胞系，和所使用的浓度，明显的肝转移可以或不可以在尸检是显而易见的。微转移病变可能与肝的组织学分析显现出来。端点会根据研究设计。 通过首先去除胆囊提取用剪刀和镊子肝脏，然后通过下腔静脉优于肝脏切断。通过腔静脉，门静脉和肝动脉劣于肝脏切。 轻轻取下整个肝脏和在1X PBS洗5倍。 分离肝分为左，右，中位数，和尾状叶。 同时在室温下振摇，在10％中性缓冲的福尔马林福尔马林修复肝48小时。流程组织中，通过增加浓度和二甲苯一系列醇;石蜡嵌入固定的组织71 </s了>。 注意：可替换地，肝脏可以通过将组织与最佳切割温度（OCT）式的cryomold和冻结在95％乙醇中浸没干冰颗粒单元冷冻。 使用切片机，切成石蜡包埋的组织块，使得组织的匹配头大小显露。 切五个4微米连续切片，这构成用于分析的第一级。 通过组织250微米切，在垃圾扔这些部分。 在250微米切割五4微米的连续切片第二级。 在整个肝脏必要时重复节。 HE染色每一级的第一部分以评估转移72。 注：对于快速冷冻的组织使用低温恒温器切段。 注：微转移病灶的检测将需要肿瘤细胞的特异性染色。 从研究中移除老鼠如果在切口有肿瘤生长坐即，因为这表明肿瘤细胞渗漏到下面的注入腹腔。 注意：此问题还没有被观察到。