Summary

Het visualiseren van de effecten van het sputum op biofilm ontwikkeling met behulp van een chambered dekglaasje Model

Published: December 14, 2016
doi:

Summary

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Abstract

Biofilms bestaan ​​uit groepen van bacteriën ingekapseld in een zelf-uitgescheiden matrix. Zij spelen een belangrijke rol bij industriële vervuiling en in de ontwikkeling en persistentie van vele gezondheid gerelateerde infecties. Een van de meest goed beschreven en bestudeerd biofilms in menselijke ziekte voorkomt bij chronische longinfectie van cystische fibrose. Bij het bestuderen biofilms in het kader van de gastheer, een groot aantal factoren biofilm vorming en ontwikkeling beïnvloeden. Om te bepalen hoe gastheerfactoren biofilm vorming en ontwikkeling kunnen beïnvloeden gebruikten we een statische chambered dekglaasje methode biofilms groeien in aanwezigheid van gastheer afkomstig factoren in de vorm van sputum supernatanten. Bacteriën worden gezaaid in kamers en blootgesteld aan sputum filtraten. Na 48 uur groei worden biofilms gekleurd met een commerciële kit biofilm levensvatbaarheid vóór confocale microscopie en analyse. Volgende beeld acquisitie, kan biofilm eigenschappen worden beoordeeld met behulp van verschillende software platforms.Deze methode stelt ons in staat om de belangrijkste eigenschappen van de biofilm groei te visualiseren in aanwezigheid van verschillende stoffen, waaronder antibiotica.

Introduction

Bacteriële biofilms zijn groepen micro-organismen die zijn bevestigd aan elkaar en ingekapseld in een zelf-uitgescheiden matrix. 1,2 klassiek, zij vertegenwoordigen bacteriën fysiek verbonden aan een abiotische of biotische oppervlak gevormd onder omstandigheden van flow. Biofilms zijn ook aangetoond dat ze groeien in statische toestand (zonder stroom) en distaal van oppervlakken, zoals bij de lucht-water grensvlak thermische zwembaden of pellicles gevormd in reageerbuizen. Deze biofilms zijn lang erkend in de omgeving en die een groot nadeel voor industriële processen zoals deze zich kunnen vormen in water reservoirs of leidingen, waardoor biofouling, corrosie en verstopping. 3,4

Biofilms zijn ook kritisch in de gezondheidszorg, zoals ze zijn getoond worden bij kathetergerelateerde infecties, longinfecties bij cystische fibrose patiënten, alsmede in talrijke andere infecties. 5,6 Een van de kenmerken van biofilm infecties is het degevouwen gevoeligheid van bacteriën tegen antibiotica en verminderde klaring van het aangeboren immuunsysteem. 7-9 De meest bestudeerde, klinisch relevante scenario's van biofilm-gebaseerde infectie optreedt bij patiënten met cystic fibrosis (CF), die chronisch besmet zijn met Pseudomonas aeruginosa biofilms. P. aeruginosa kan bij instelling van chronische infectie die het zeer moeilijk te behandelen een aantal wijzigingen ondergaan. 10,11 Biofilms kunnen differentieel activeren aangeboren immuniteit en rijden ontsteking. 12-14 Al deze infecties leiden tot verhoogde morbiditeit en mortaliteit bij CF-patiënten, is het cruciaal om factoren die invloed hebben biofilm ontwikkeling in dit verband verstaan.

Een recente studie suggereert dat gastheer-factoren zijn cruciaal bij de vorming van biofilm P. aeruginosa aggregaten. 15 Deze biofilms bijdragen tot verminderde gevoeligheid voor antibiotica en gastheer afweermechanismen. de presentie van gastheer afkomstig factoren, zoals neutrofiel elastase, alsook uitgescheiden producten van micro-organismen in de CF longen, het potentieel sterk moduleren vorming en ontwikkeling biofilm. 16 Daarnaast biofilms interactie met de gastheer voor expressie van een groot cascades en een ontstekingsproces. Terwijl hoge doorvoer werkwijzen, zoals de standaard kristalviolet assay kan enige informatie met betrekking tot de biofilm werkwijze, visualisatie van de biofilm in reactie op deze factoren zorgen voor meer gedetailleerde informatie.

In dit manuscript beschrijven we een werkwijze voor het gebruik van factoren uit het sputum van patiënten met CF biofilmvorming in vitro bestuderen. Deze methode zorgt voor een snelle visualisatie van biofilms blootgesteld aan sputum met gastheer factoren met behulp van een commercieel biofilm levensvatbaarheid kit. Deze techniek kan worden gebruikt om visueel veranderingen die optreden tijdens biofilmgroei te identificeren in de aanwezigheid van exogenoons producten, en vertegenwoordigt een verbeterde werkwijze voor de veranderingen in biofilm ontwikkeling onder verschillende omstandigheden te analyseren.

Protocol

Merk op dat Research Ethics Board (REB) moet verzamelen en opslaan sputum monsters uit proefpersonen. Deze studies werden goedgekeurd door het Hospital for Sick Children REB # 1000019444. 1. Voorbereiding CF sputum Verzamel sputum monster van patiënten tijdens een routine bezoek aan de cystic fibrosis clinic en blijf op ijs. Vervoeren sputum monster op het ijs binnen het eerste uur van de collectie, aan het onderzoekslaboratorium, de verwerking te ondergaan. <…

Representative Results

Het totale ontwerp van het experiment weergegeven in figuur 1. Het gebruik van dit protocol een handige methode om de wijzigingen in biofilms gekweekt voor verschillende tijdsperioden (bijvoorbeeld 24, 48 of 72 uur) zichtbaar. Belangrijker exogene signalen, zoals sputum filtraat kan worden toegevoegd aan de veranderingen in de biofilm ontwikkeling visualiseren. Zoals blijkt uit figuur 2, kan de aanwezigheid van 10% sputum filtraten de architectu…

Discussion

De hierin beschreven werkwijzen maken voor visualisatie van bacteriële biofilms gekweekt in de aanwezigheid van exogeen producten. Niet verrassend, de productie van de exoproducts van belang bij gebruik van dit type systeem. Bijvoorbeeld, dithiothreitol (DTT), wordt vaak gebruikt op menselijke sputum monsters om vloeibaar monsters. Echter, het effect van DTT alleen biofilm ontwikkeling en levensvatbaarheid verlagen (gegevens niet getoond). Aldus juiste controles voor alle omstandigheden noodzakelijk. Verder is de toevo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

TB erkent een research fellowship van Cystic Fibrosis Canada.

Materials

Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well Thermo Sicher Scientific 155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit Thermo Fisher Scientific L10316
Blood agar plates Thermo Fisher Scientific R10215 Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT Availble software online COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk 
Millers LB Broth Thermo Fisher Scientific 12780-052 Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters Millipore SLGV013SL Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) Oxoid BR0014G Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD QS Technologies Inc.
Spectral Borealis Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity QS Technologies Inc. Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf

References

  1. Beaudoin, T., Waters, V. Infections with biofilm formation: selection of antimicrobials and role of prolonged antibiotic therapy. Pediatr.Infect.Dis.J. , (2016).
  2. Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg.Infect.Dis. 8 (9), 881-890 (2002).
  3. Hobley, L., Harkins, C., MacPhee, C. E., Stanley-Wall, N. R. Giving structure to the biofilm matrix: an overview of individual strategies and emerging common themes. FEMS Microbiol.Rev. 39 (5), 649-669 (2015).
  4. Katharios-Lanwermeyer, S., Xi, C., Jakubovics, N. S., Rickard, A. H. Mini-review: Microbial coaggregation: ubiquity and implications for biofilm development. Biofouling. 30 (10), 1235-1251 (2014).
  5. Donlan, R. M. Biofilm formation: a clinically relevant microbiological process. Clin.Infect.Dis. 33 (8), 1387-1392 (2001).
  6. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends Microbiol. 21 (9), 466-474 (2013).
  7. Mah, T. F., Pitts, B., Pellock, B., Walker, G. C., Stewart, P. S., O’Toole, G. A. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426 (6964), 306-310 (2003).
  8. Mah, T. F. Biofilm-specific antibiotic resistance. Future Microbiol. 7 (9), 1061-1072 (2012).
  9. Beaudoin, T., Zhang, L., Hinz, A. J., Parr, C. J., Mah, T. F. The biofilm-specific antibiotic resistance gene ndvB is important for expression of ethanol oxidation genes in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J. Bacteriol. 194 (12), 3128-3136 (2012).
  10. Beaudoin, T., Aaron, S. D., Giesbrecht-Lewis, T., Vandemheen, K., Mah, T. F. Characterization of clonal strains of Pseudomonas aeruginosa isolated from cystic fibrosis patients in Ontario, Canada. Can. J. Microbiol. 56 (7), 548-557 (2010).
  11. Vidya, P., et al. Chronic infection phenotypes of Pseudomonas aeruginosa are associated with failure of eradication in children with cystic fibrosis. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. , (2015).
  12. Beaudoin, T., Lafayette, S., Nguyen, D., Rousseau, S. Mucoid Pseudomonas aeruginosa caused by mucA mutations result in activation of TLR2 in addition to TLR5 in airway epithelial cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. 428 (1), 150-154 (2012).
  13. Beaudoin, T., et al. The level of p38alpha mitogen-activated protein kinase activation in airway epithelial cells determines the onset of innate immune responses to planktonic and biofilm Pseudomonas aeruginosa. J.Infect.Dis. 207 (10), 1544-1555 (2013).
  14. LaFayette, S. L., et al. Cystic fibrosis-adapted quorum sensing mutants cause hyperinflammatory responses. Sci.Adv. 1 (6), e1500199 (2015).
  15. Staudinger, B. J., et al. Conditions associated with the cystic fibrosis defect promote chronic Pseudomonas aeruginosa infection. Am.J.Respir.Crit.Care Med. 189 (7), 812-824 (2014).
  16. Kennedy, S., et al. Activity of Tobramycin against Cystic Fibrosis Isolates of Burkholderia cepacia Complex Grown as Biofilms. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 348-355 (2015).
  17. Tom, S. K., Yau, Y. C., Beaudoin, T., LiPuma, J. J., Waters, V. Effect of High-Dose Antimicrobials on Biofilm Growth of Achromobacter Species Isolated from Cystic Fibrosis Patients. Antimicrob.Agents Chemother. 60 (1), 650-652 (2015).
  18. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
  19. Vorregaard, M. . Informatics and Mathematical Modelling. , (2008).
  20. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro Biofilm Formation in an 8-well Chamber Slide. J. Vis. Exp. (47), e2481 (2011).

Play Video

Cite This Article
Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model. J. Vis. Exp. (118), e54819, doi:10.3791/54819 (2016).

View Video