Methods to accurately measure retinoic acid (RA) levels in small amounts of tissue do not exist. This protocol describes the easy, quantitative measurement of relative RA levels in E8.5 embryos and neurospheres using an RA reporter cell line.
Retinoic acid (RA) is an important developmental morphogen that coordinates anteroposterior and dorsoventral axis patterning, somitic differentiation, neurogenesis, patterning of the hindbrain and spinal cord, and the development of multiple organ systems. Due to its chemical nature as a small amphipathic lipid, direct detection and visualization of RA histologically remains technically impossible. Currently, methods used to infer the presence and localization of RA make use of reporter systems that detect the biological activity of RA. Most established reporter systems, both transgenic mice and cell lines, make use of the highly potent RA response element (RARE) upstream of the RAR-beta gene to drive RA-inducible expression of reporter genes, such as beta-galactosidase or luciferase. The transgenic RARE-LacZ mouse is useful in visualizing spatiotemporal changes in RA signaling especially during embryonic development. However, it does not directly measure overall RA levels. As a reporter system, the F9 RARE-LacZ cell line can be used in a variety of ways, from simple detection of RA to quantitative measurements of RA levels in tissue explants. Here we describe the quantitative determination of relative RA levels generated in embryos and neurosphere cultures using the F9 RARE-LacZ reporter cell line.
حمض الريتينويك (RA) هو مشتق الأيض الريتينول أو فيتامين (أ) ويتم إنتاج من خلال النشاط متتابعة من عدة أنزيم نازع للهيدروجين الخلوية 1. بسبب الطبيعة الكيميائية amphiphatic، فإنه يعبر بسهولة الأغشية الدهنية ويمكن أن تكون بمثابة عامل تخلقية للذوبان 1. وهو جزيء الضروري أن ينظم العديد من العمليات الخلوية التنموية والكبار عن طريق العمل كمركز ليجند لمستقبلات ريتينويد النووية وتفعيل التعبير الجيني 2-10. دون RA، هذه المستقبلات RA (RARS) راريس ربط في الحمض النووي، وتقوم بدور repressors. RA ملزمة لهذه المستقبلات تحولهم إلى تفعيل النسخي مما أسفر عن هدف التعبير الجيني 1،5،6.
على الرغم من أن مسار RA إشارات تتميز بشكل جيد، وحجم صغير (~ 300 دا) وطبيعة متقابلة الزمر للاتحاد الإقليمي يجعل التصور النسيجي المباشر وقياس RA حاليا غير مجد من الناحية الفنية 11. الطريقة الوحيدة للديرإلخ قياس مستويات RA هو من خلال عزل RA من عينات الأنسجة باستخدام عالية الأداء اللوني السائل (HPLC) 11. يتطلب هذا الأسلوب عادة كميات كبيرة من الأنسجة، ويسر عن طريق تجميع عينات مختلفة 12. وهكذا، وهذا الأسلوب هو ضعيف مناسبة لقياس مستويات RA في الأجنة الفردية أو كميات صغيرة من عينة / الأنسجة.
من أجل التحقيق في وظيفة الخلايا من التهاب المفاصل الروماتويدي، وقد وضعت عدة طرق للاستدلال غير مباشر وجود التهاب المفاصل الروماتويدي. هذه الطرق الاستفادة من أنظمة مراسل تحتوي على عالية الاستجابة RAR بيتا نادر القيادة التعبير عن بيتا غالاكتوزيداز أو وسيفيراز 11،13،14. ونادر-LacZ مراسل الفئران المحورة جينيا الناتجة عن Rossant وآخرون. 13 هو النظام المثالي لتصور المناطق الزمانية المكانية للاتحاد الإقليمي إشارات في الموقع 11،13،15،16 لكن غير مناسب لقياس الكمي. وF9 خط الخلية نادر-LacZ 14، على روقال انه ومن ناحية أخرى، أمر مفيد للكشف عن التهاب المفاصل الروماتويدي والقياسات الكمية للمستويات RA في إإكسبلنتس الأنسجة 11،12،14،17،18.
خلايا سرطانة مسخية F9 تعبر ألفا الذاتية وبيتا، وحمض غاما الريتينويك مستقبلات 19، والشروع التمايز إلى الأديم الجدارية بعد التعرض لالتهاب المفاصل الروماتويدي 19-21. ولطالما تم إنشاء خلايا F9 كنموذج للتمايز الخلايا التي يسببها التهاب المفاصل الروماتويدي، والذي هو السبب في اختياره كخط خلية مثالية للمقايسة مراسل RA. وسيل 15 RA خط الخلية مراسل المستمدة F9 الناتجة عن فاغنر وآخرون. 14 يحتوي على E. coli'LacZ الجين المصب من نسخة واحدة من 64 شركة بريتيش بتروليوم الريتينويك عنصر استجابة حمض (نادر) من (RAR بيتا) الجينات بيتا الريتينويك البشري حمض مستقبل. من أجل تحديد والحفاظ على الحيوانات المستنسخة مستقرة، يتضمن بناء أيضا الجين أمينوغليكوزيد ناقلة الفسفات (ص الأجسام القريبة من الأرض) كعلامة اختيار في وجود G418. هذا البناء المشتركnfers التعبير محرض للب غالاكتوزيداز في وجود التهاب المفاصل الروماتويدي، والتي يمكن أن تصور من خلال تلطيخ LacZ وهذا الرد يمكن أن يكون في وقت لاحق كميا باستخدام الأساليب اللونية 11،12،14،18.
وقد استخدم هذا الخط خلية مراسل متعددة للغاية على نطاق واسع في الكشف عن إنتاج RA الذاتية من خلال ثقافة مشتركة من عينات الأنسجة مع الخلايا المراسل، مثل قوقعة 17 و الجنينية إإكسبلنتس لوحة الطابق 14. وبالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا الخط مراسل لتقدير مستويات RA في الحبل الشوكي النامية عن طريق زراعة أقسام المجمعة من النخاع الشوكي الجنينية بشكل منفصل وإضافة وسائل الإعلام مكيفة من هذه الثقافات إلى F9 الخلايا نادر-LacZ 18. وقد أجريت الكمي بعد LacZ تلطيخ من خلال القراءة اللونية باستخدام معيار ELISA لوحة القارئ 11،12،18. وأخيرا، تم استخدام هذا الخط الخلية مراسل في الكشف عن وجود التهاب المفاصل الروماتويدي الإنزيمات الأيضية التي كتبها monitoriالتغييرات نانوغرام في مستويات RA 12،18.
نحن هنا أبلغكم أن حساسية هذا الخط خلية مراسل يسمح أيضا لقياس مستويات RA المتولدة من الأجنة E8.5 شارك مثقف الفردية. وهذا يتيح للمقارنة بين الأجنة الفردية من المورثات مختلفة. وكمثال محدد، Gpr161 هو النوع من الاختزال اليتيم الذي ينظم تكون العصيبة جزئيا من خلال RA إشارات الطريق 22، ونفيدكم باستخدام هذا الخط خلية مراسل لدراسة تأثير طفرة المتنحية في Gpr161 (Gpr161 فل) على مستويات RA الشاملة في جنين. بالإضافة إلى ذلك، فإن تعدد وسهولة في استخدام هذا النظام مراسل يسمح للحرية لقياس ومقارنة مستويات RA في عينات الأنسجة المختلفة، حتى في الثقافات neurosphere تم الحصول عليها من خلايا الجذعية في العمود الفقري الكبار. نحن هنا وصف تحديد كمية مستويات RA النسبية في الأجنة والثقافات neurosphere من خلال المباشرة ثقافة مشتركة مع F9 نادر-LacZ RA مندوبخط الخلية orter.
خط الخلية نادر-LacZ F9 14 هو نظام قوي التي يمكن استخدامها للكشف عن التهاب المفاصل الروماتويدي التي تنتجها الأنسجة إإكسبلنتس 12،14،17،18. أنه حساس لتركيزات RA منخفضة تصل إلى 100 FM، مع عدم وجود استجابة غير محددة في الكشف عن الخلايا غير المعالجة مع RA 12،14،18. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا مراسل تستجيب لجميع العابر RA بطريقة خطية ضمن نطاق معين من التركيز، مما يسمح للرد فعل LacZ ليكون كميا وتستخدم لتحديد حجم مستويات RA 12،14،18. مقايسة مراسل RA سريعة وسهلة المعروضة هنا يستخدم لنادر-LacZ خط الخلية مراسل F9 لتصور (الشكل 2) والقياس الكمي النسبي (الشكل 3) من الأجنة والكبار مثقف الخلايا الجذعية العصبية. هذا النظام مراسل يسمح بمقارنة مستويات RA الذاتية بين العينات الفردية، كما هو مبين في الشكل 2، وهي حساسة بما يكفي لتكون قادرة على الكشف عن التهاب المفاصل الروماتويديتولدها الأجنة الفردية E8.5 (الشكل 2A)، وكذلك التهاب المفاصل الروماتويدي التي تنتجها neurospheres مثقف (الشكل 2B). استجابة تعتمد على الجرعة من هذا الخط الخلية لتركيزات RA متفاوتة تسمح لتقدير مستويات RA (الشكل 3A) في عينات وكذلك المقارنة بين مستويات RA النسبية بين العينات (الشكل 3B). من المهم أن نلاحظ أن خط الخلية مراسل نادر F9 يقيس المبلغ الإجمالي للاتحاد الإقليمي المتولدة عن عينة من النسيج على الوقت من الحضانة. هذا هو ما يعادل صافي رصيد التوليف RA وهدم.
في حين أن نادر-LacZ نظام مراسل خلية F9 حساس للغاية وتنوعا، وهناك عدة خطوات حل المشاكل الحرجة التي أدخلنا من أجل ضمان موثوقية من هذا النظام. أولا، كما هو مبين في الشكل رقم 1، من المهم للحفاظ على صحة هذه الخلايا عن طريق الممرات العادية من دون السماح لهم زصف إلى confluency. ثانيا، لقد لوحظ في وقت لاحق الممرات عادة ما ينتج عنها ردود RA متناسقة، حتى لو تم الحفاظ على الثقافات باستمرار تحت التحديد مع G418. لاستكشاف هذا، فمن المستحسن أن تجاهل الثقافات بعد 20 الممرات وذوبان الجليد قارورة جديدة. وبالإضافة إلى ذلك، يجب إجراء فحوصات منتظمة للتأكد من أن الخلايا لا تزال مراسل المستجيبين قوية على وجود التهاب المفاصل الروماتويدي في وسائل الإعلام. ثالثا، إذا عرض الممرات مبكرة الاستجابة الضعيفة أو غير موحدة إلى RA (الشكل 1B، يسار)، واحد أو عدة جولات من استنساخ فرعي قد تكون ضرورية حتى يتم الحصول على المستجيبين قوية (الشكل 1B، تي righ). وأخيرا، قبل أن تشارك في الثقافة، فمن المستحسن أن عينات الأنسجة مثل الأجنة وneurospheres يتم فصل الخلايا واحدة. وقد لاحظنا أن تفارق من نتائج العينات في القياسات اللونية أكثر اتساقا. قد يكون هذا يرجع إلى توزيع أكثر عدالة للاتحاد الإقليمي في الآبار الثقافة، كما فصل الخلايا هي في يونيشكل من أشكال الاتصال مع الخلايا المراسل.
وقدمت العديد من التعديلات أيضا على بروتوكول الأصلي 14. أولا، تم كميا استجابة RA الخلايا نادر-LacZ F9 عن طريق تحديد بشكل مباشر على الخلايا وقياس الامتصاصية في 610 نانومتر بدلا من جمع الخلايا وتحليل المحللة للنشاط ب غالاكتوزيداز 14. تعديل آخر هو المباشرة ثقافة مشتركة من عينات فصلها مع F9 نادر-LacZ قبل القياس الكمي للاستجابة RA. وذكرت وسائل السابقة زرع العينات بشكل منفصل وإضافة فقط وسائل الإعلام من هذه الثقافات إلى F9 نادر-LacZ 16،18.
على الرغم من كونه نظام القوية، وF9 نادر-LacZ مراسل مقايسة لديها العديد من القيود. واحد الحد من هذا الخط خلية المراسل هو أنه على الرغم من أنه يستجيب بقوة لوجود جميع العابر RA، فإنه يستجيب أيضا لأيزومرات حمض الريتينويك الأخرى بما في ذلك 9-رابطة الدول المستقلة-RA و 13 رابطة الدول المستقلة للاتحاد الإقليمي؛ ومع ذلك، فإنها هي 100 أضعاف أكثر حساسية لجميع العابر المقارنة RAالأحمر بأيسومرات أخرى 18. الحد أخرى لهذا النظام هو أن استجابة تعتمد على الجرعة الخطية يقع فقط بين 10 -13 م إلى 10 -7 M في-RA 14،18. وبالتالي، إذا بمقارنة مستويات RA خارج هذه الحدود، فإنه قد يكون من الضروري إجراء تخفيف التسلسلي للعينة حتى سقوط القياسات ضمن مجموعة خطية. وأخيرا، لأن هذا هو في المقام الأول مقايسة اللونية، ونقطة النهاية للتنمية اللون تختلف بين العينات والتجارب. وبالتالي، فمن المهم أن منحنى القياسية دائما تكون مطلية بشكل متواز لكل تجربة واحدة من أجل استخدامها لتقدير حجم خلية الرد المراسل.
في الختام، لقد ذكرت استخدام خط الخلية مراسل F9 نادر-LacZ RA RA لقياس مستويات كميا في الأجنة E8.5 ووغير المبلغ عنه سابقا، في neurospheres. براعة هذا النظام المراسل قد تسمح لتقدير مستويات RA في أي خلية أو نسيج نوع تقريبا، ومعبد المنعم يوسف يؤدي إلى تطوير تطبيقات متنوعة في المستقبل.
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) for providing us with the F9 RARE-LacZ cells and technical support. This study is funded by the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (NJCSCR) (Grantnumber:10-3092-SCR-E-0) and the New Jersey Commission on Brain Injury Research (NJCBIR) (Grant number: CBIR13FEL006).
C3H/HeSn-Gpr161vl/J mouse strain | Jackson Laboratory | 000316 | |
F9 RARE-LacZ reporter cell line | from Dr. Michael Wagner (SUNY Downstate Medical Center) and Ben Thiede (Dr. Jeff Corwin lab, University of Virginia) | ||
DMEM/F-12 (with L-glutamine and HEPES) | ThermoFisher Scientific | 11330-057 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm in 37 C for media preparation |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Store at -20 °C in 10-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; light-sensitive |
G418 | ThermoFisher Scientific | 10131-027 | Store at 4 °C; light-sensitive |
2% Gelatin | Sigma Aldrich | G1393 | Store at 4 °C |
B-27 supplement (2 % stock solution) | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | Store at -20 °C in 1-ml aliquots to avoid repeated freeze-thaw; warm at room temperature for media preparation |
Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 °C |
Murine Fibroblast Growth Factor (FGF)-basic | PeproTech | 450-33 | Prepare 100 μg/ml stock solution in 0.1% bovine serum albumin (BSA) in 1X PBS; prepare working concentrations by diluting with 1X PBS; store at -20 °C |
50% glutaraldehyde | Amresco | M155 | Store at 4 C |
Sodium deoxycholate monohydrate (C24H39NaO4 · H2O) | Sigma Aldrich | D5670 | Store at room temperature |
potassium ferrocyanide (K₄[Fe(CN)₆] · 3H₂O) | Sigma Aldrich | P-9387 | Store at room temperature |
potassium ferricyanide (K₃[Fe(CN)₆]) | Sigma Aldrich | P-8131 | Store at room temperature |
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-galactopyranoside) | Promega | V3941 | Store stock at -20 °C |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 41639 | Store at room temperature |
all-trans Retinoic Acid (at-RA) | Sigma Aldrich | R-2625 | Store 1 ml aliquots of stock in -80 °C; extremely sensitive to light |
TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12605-010 | Store at room temperature |
0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200-056 | alternative to TrypLE Express; aliquot and store at -20 C |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | Store at 4 C |
10X phosphate buffered solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | 10010-023 | Store at 4 C |
Papain | Worthington | LK003176 | Store at 4 °C. |
Trypsin | Worthington | LS003703 | Store in 1 ml aliquots at -20 °C. |
Hyaluronic acid | Calbiochem | 385908 | Store 200 μl aliquots at -20 °C. |
DNaseI | Worthington | LS002139 | Store in 200 μl aliquots at -20 C |
Kynurenic acid | Sigma Aldrich | K3375 | Store in 200 μl aliquots at -20 C |
95% ethanol | |||
Mr. Frosty Freezing container | ThermoFisher Scientific | 5100-0001 | |
10 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
10 cm culture dish (cell culture treated) | |||
6 cm culture dish (non-cell culture treated) | |||
96-well cell culture plates | |||
1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
1.5 ml amber microcentrifuge tubes | |||
1.5 ml cryovials | |||
37 °C water bath | |||
surgical scissors | |||
fine surgical scissors | |||
no. 5 forceps | |||
blunt-ended forceps | |||
scalpel blade | |||
glass pasteur pipettes | |||
cotton | |||
alcohol lamp | |||
ELISA plate reader | |||
stereomicroscope |