Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
Trypanosoma brucei является простейшим паразитом , который вызывает африканский trypanosomasis и Нагана человека у крупного рогатого скота. Т. brucei является идеальным организмом для анализа функции белка за счет сочетания высокого качества генома, многочисленные протеомики и транскриптомике наборов данных и хорошо разработанных молекулярных инструментов 1-3. Достижения в области протеомики и секвенирования привели больших наборов данных , которые выдвигают на первый план потенциально интересных генов 4-6; Тем не менее, многие гены имеют минимальную информацию, связанную с ними в существующих базах данных. Существует, следовательно, потребность в способе с высокой пропускной способностью, чтобы помочь белка функциональную характеристику.
Выражение помеченной белка может дать множество проникновения в суть зависит работа белка. Например, белок, помеченный флуоресцентным белком или эпитоп, может быть локализован с помощью флуоресцентной микроскопии, который дает информацию о том, где ProtEin может оказывать свое биологическое действие. В качестве альтернативы, белок с меткой ПВР 7, 8 или HaloTag Его тег может быть очищен для биохимических анализов и идентификации его партнеров взаимодействия.
Недавно мы разработали надежную методологию мечения T. brucei 9. Это используется длинный праймеров ПЦР для создания ДНК для трансфекции и позволил мечение десятков белков параллельно – значительное усовершенствование существующих протоколов. В настоящее время мы улучшили масштабируемость этого протокола в проциклической формах по порядку величины. Здесь мы представляем наш метод, где мы проводим ПЦР и трансфекции в 96-луночные планшеты, с восстановлением и отбора, происходящего в 24-луночных планшетах. Как сотни белков теперь могут быть помечены параллельно этот метод обеспечивает экономически эффективный и действенный метод мечения весь геном трипаносомы.
Заметное улучшение в чувствительности протеомики и методов транскриптомике в последние 5-10 лет предоставил ценные данные о тысячах генов и их продуктов. Тем не менее, инструменты для решения функции этих белков не поспевают.
Пометка белок облегчает многочисленные эксперименты, чтобы определить свою функцию. Например, белок может быть слит с флуоресцентным белком в различных цветовых решениях, чтобы способствовать локализации и совместной локализации исследований. Теги разработаны для электронной микроскопии, такие как APEX2 или miniSOG 11,12, позволяют ультраструктурную локализации меченого белка. Метки к биохимии, такие как ТАР тег и ProtC-TEV-Prota (PTP) тег 7,13 возможность очистки комплексов , связанных с белком для идентификации партнеров по связыванию или в пробирке биохимических анализов.
Конкретные шаги, которые имеют решающее значение для успеха protocола: включение ДМСО в Master Mix ПЦР 1, замерзание PCR Master Mix 1 до добавления Master Mix 2, использование коммерческой полимеразы в Master Mix 2 и модификации буфера cytomix электропорации. По нашему опыту, необходимо использовать двойное количество ячеек для C терминала мечения трансфекциях, как для N терминала мечения трансфекциях для достижения аналогичной пропорции положительных скважин. Таким образом, все шаги должны быть выполнены, как описано.
Этот метод только, вероятно, будет успешным, когда трансфекцию насекомого проциклической формы трипаносом. Кровоток формы имеют более низкую эффективность 14 трансфекции, к тому же они, вероятно, умирают во время выбора из – за зависящей от плотности токсичности , которая не связана с селективным препаратом. Таким образом, наш предыдущий протокол представляет текущую наилучшую технологию для мечения кровотока формы трипаносом 9. Также вероятно, что трансЭффективность фекции будет варьироваться в зависимости от конкретного трипаносом изолята. Этот протокол был оптимизирован с использованием 927 SMOX проциклической формы – другие штаммы могут потребовать дополнительной оптимизации. Меры, которые могут увеличить вероятность успеха включают: увеличение количества ПЦР-ампликонов, увеличение числа клеток, включенных в трансфекции.
Мы представляем метод, где сотни белков могут быть помечена параллельно. Это облегчит крупномасштабные исследования по локализации и взаимодействия, дополняя существующие большие наборы данных и оказывает неоценимую информацию для сообщества. Грунтовка шаблоны доступны по запросу и список шаблонов плазмид доступна: http://www.sdeanresearch.com/
The authors have nothing to disclose.
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
dNTP | any reputable | ||
Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
Phleomycin | Melford | P0187 | |
225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |