Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.
Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.
Trypanosoma brucei är en protozo parasit som orsakar mänskligt afrikansk trypanosomasis och nagana hos nötkreatur. T. brucei är en idealisk organism för analys av proteinfunktion på grund av kombinationen av en hög kvalitet genom, talrika proteomik och transkriptomik datauppsättningar och väl utvecklade molekylära verktyg 1-3. Framsteg inom proteomik och sekvensering har resulterat i stora datamängder som framhäver potentiellt intressanta gener 4-6; Men många gener har minimal information i samband med dem i befintliga databaser. Det finns därför ett behov av en hög genomströmning metod för att underlätta protein funktionell karakterisering.
Uttryck av ett märkt protein kan ge en mångfald av insikter i ett proteins funktion. Till exempel kan ett protein märkt med ett fluorescerande protein eller epitop lokaliseras genom fluorescensmikroskopi, som ger information om var protein kan utöva sin biologiska verkan. Alternativt kan ett protein märkt med en TAP 7, HaloTag 8 eller His tag kan renas för biokemiska analyser och identifiering av dess interaktion partners.
Vi utvecklade nyligen en robust märkning metod för T. brucei 9. Detta används lång primer PCR för att generera DNA för transfektion och tillät märkning av dussintals proteiner parallellt – en stor förbättring av befintliga protokoll. Vi har nu förbättrat skalbarhet av detta protokoll i procyclic former av en storleksordning. Här presenterar vi vår metod där vi utföra PCR och transfektion in i 96-brunnsplattor, med återhämtningen och urval som uppträder i 24-brunnsplattor. Som hundratals proteiner kan nu märkas parallellt denna metod ger en kostnadseffektiv och genomförbar metod för att märka hela trypanosom genomet.
Dramatiska förbättringar i känslighet proteomik och transkriptomik metoder under de senaste 5-10 åren har gett värdefulla data på tusentals gener och deras produkter. Men de verktyg itu med funktionen av dessa proteiner har inte hållit jämna steg.
Märka ett protein underlättar många experiment för att bestämma dess funktion. Till exempel kan ett protein fuseras till ett fluorescerande protein i en mängd olika färger för att underlätta lokalisering och co-lokaliseringsstudier. Taggar utvecklad för elektronmikroskopi, såsom APEX2 eller miniSOG 11,12, tillåter ultrastrukturell lokalisering av det märkta proteinet. Taggar för biokemi, såsom TAP-taggen och ProtC-TEV-ProtA (PTP) märka 7,13 medge rening av komplex associerade med proteinet för identifiering av bindningspartners eller in vitro biokemiska analyser.
De specifika stegen som är avgörande för framgången för protocol är: införlivandet av DMSO i PCR Master Mix 1, frysning av PCR Master Mix en före tillsatsen av Master Mix 2, användning av kommersiella polymeras i Master Mix 2 och modifiering av cytomix elektroporering buffert. I vår erfarenhet, är det nödvändigt att använda dubbelt så många celler för C terminal tagg transfektioner som för N terminal tagg transfektioner i syfte att uppnå en lika stor andel av positiva brunnar. Därför bör alla steg utföras som beskrivits.
Denna teknik är endast sannolikt att bli framgångsrika när transfektion insekten procyclic formen trypanosom. Blodomloppet former har en lägre transfektionseffektivitet 14 dessutom de sannolikt kommer att dö under val på grund av densitetsberoende toxicitet som inte har samband med den selektiva drogen. Därför representerar vår tidigare protokoll dagens bästa teknik för att märka av blodomloppet bildar trypanosomer 9. Det är också troligt att transfection effektivitet varierar beroende på den specifika trypanosom isolat. Detta protokoll har optimerats med hjälp av 927 SMOX procyclic former – andra stammar kan kräva ytterligare optimering. Åtgärder som kan öka sannolikheten för framgång är: att öka mängden PCR-amplikon, vilket ökar antalet celler som ingår i transfektion.
Vi presenterar en metod där hundratals proteiner kan märkas parallellt. Detta kommer att underlätta storskaliga studier om lokalisering och interaktion, som kompletterar befintliga stora datamängder och ge ovärderlig information till samhället. Primer mallar finns tillgängliga på begäran och en förteckning över plasmider mallar är tillgänglig från: http://www.sdeanresearch.com/
The authors have nothing to disclose.
SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.
Oligonucleotide | Life technologies | na | desalt only (do not use additional purification) |
DMSO | Roche | Included with the Expand HiFi pack | Must be PCR grade |
dNTP | any reputable | ||
Expand HiFi polymerase | Roche | 11759078001 | |
BTX ECM830 | Harvard Apparatus | Electroporator | |
HT-200 plate handler | Harvard Apparatus | HT-200 | Handles the 96-well eletroplates |
MOS 96 ELECTROPLATE 4mm | Harvard Apparatus | 45-0452 | Electroplate for the 96-well electroporation |
Blasticidin S Hydrochloride | Melford | 3513-03-9 | |
Hygromycin b Gold | Invivogen | ant-hg-1 | |
Phleomycin | Melford | P0187 | |
225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap | Appletonwoods | BC006 | |
24 well culture plates | Appletonwoods | BC017 | |
Eppendorf® PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Sigma Aldrich | Z606634-1EA | |
96-well Multiply® PCR plate with lateral skirt | Sarstedt | 72.1979.203 |