Summary

In Vitro Транскрипция Анализы и их применение в Drug Discovery

Published: September 20, 2016
doi:

Summary

In this manuscript, we describe a protocol to functionally examine transcription and the inhibitory activity of antibacterial agents targeting bacterial transcription.

Abstract

В пробирке транскрипции анализы были разработаны и широко использовались в течение многих лет , чтобы изучить молекулярные механизмы , участвующие в транскрипции. Этот процесс требует множества субъединиц ДНК-зависимой РНК-полимеразы (РНКП) и ряд факторов транскрипции, которые действуют, чтобы модулировать активность РНКП во время экспрессии генов. Секвенирование гель-электрофорез радиоактивно меченных транскриптов используется, чтобы обеспечить подробную механистическую информацию о том, как Транскрипция происходит, и какие параметры могут повлиять на нее. В этой статье мы опишем протокол для изучения того, как существенный фактор элонгации Нуса регулирует транскрипционный приостановку, а также способ идентификации антибактериальный агент таргетирования инициации транскрипции путем ингибирования холофермента формирования РНКП. Эти методы могут быть использован в качестве платформы для разработки дополнительных подходов для изучения механизма действия факторов транскрипции, которые до сих пор остаются неясными, а также новые антибактериальные AgenТ.С. ориентации транскрипции, которая является объектом недоиспользованными наркотиков в исследования и разработки антибиотиков.

Introduction

Транскрипция является процессом, в котором РНК синтезируется из определенной ДНК-матрицы. В эукариотических клетках имеются три различных РНКП: РНК-полимераза I расшифровывает предшественников рРНК, РНК-полимераза II отвечает за синтез мРНК и определенных малых ядерных РНК, и синтез 5S рРНК и тРНК осуществляется РНКП III. У бактерий существует только одна РНК-полимераза отвечает за транскрипцию всех классов РНК. Есть три стадии транскрипции: инициация, удлинение и прекращение. Транскрипция является одним из наиболее регулируемых процессов в клетке. Каждая стадия в цикле транскрипции представляет собой контрольную точку для регуляции экспрессии генов 1. Для инициирования, РНК – полимераза должен ассоциировать с коэффициентом сигмы с образованием Голоэнзим, которое требуется , чтобы направить фермента к определенным узлам , называемые промоторами 2 с образованием открытого промотора комплекса. Впоследствии, большой набор факторов транскрипции отвечают за регулирование Oдеятельность F РНКП во время удлинения и терминации фаз. Фактор транскрипции рассматриваемых здесь является высоко консервативным и существенным содержанием белка, Нуса. Он участвует в регуляции транскрипции Приостановка и прекращение, а также анти-терминацию в процессе синтеза рРНК 3-5.

В пробирке транскрипции анализы были разработаны в качестве мощных инструментов для изучения сложных регуляторных мер во время транскрипции 6. В общем случае, линейный фрагмент ДНК, в том числе области промотора необходим в качестве матрицы для транскрипции. ДНК-матрицы, как правило, генерируются с помощью ПЦР или путем линеаризации плазмиды. Затем добавляют Очищенные белки и НТП (в том числе один меченый NTP для обнаружения целей) и продукт анализировали после необходимого периода инкубации. С использованием соответствующих шаблонов и условий реакции, все этапы транскрипции были исследованы с помощью этого подхода, который позволил подробную молекулярную характеристику Transcription за последние полвека 7. В сочетании с информацией о 3-мерной структуре РНКП это также оказалось возможным исследовать молекулярный механизм ингибирования транскрипции антибиотиков и антибиотиков приводит, и использовать эту информацию при разработке новых, усовершенствованных лекарств 8-10.

В данной работе мы приводим примеры того, как транскрипционные анализы могут быть использованы для определения механизма регуляции транскрипции путем удлинения / фактора прекращения Нуса, а также как механизм действия нового ингибитора инициации транскрипции свинца может быть определена.

Protocol

Внимание: Эксперименты предполагают использование радиоактивного изотопа 32 P и никакой работы не следует проводить до тех пор , все надлежащие условия безопасности не были соблюдены. Как правило, персонал обязаны посещать курс по технике безопасности и пройти практику под наблюдением пере?…

Representative Results

эффективность транскрипции может быть определено путем измерения уровня излучения в полосах в различные моменты времени. Паузу для анализа , чтобы проверить функцию Нуса фактора позволило визуализировать паузы, прекращения и стекания продуктов (Рис . 1А…

Discussion

Во всех организмах, транскрипция является жестко регулируется процесс. В пробирке транскрипции анализы были разработаны , чтобы обеспечить платформу для тестирования эффектов транскрипционных факторов, малых молекул и ингибиторов транскрипции. В этом методе бумаги, анализ мето?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work acknowledges a Faculty Early Career Grant from the University of Newcastle (CM).

Materials

Obtain the proteins required for transcription assay
E. coli RNAP Epicentre S90250
Preparation of DEPC-treated water
diethyl pyrocarbonate (DEPC)  Sigma-Aldrich  D5758
RNase-free water 
Ambion Nuclease-Free Water ThermoFisher AM9937
DNA template preparation
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System Promega A1330
ACCUZYME Mix Bioline BIO-25028
PCR primers
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega A9281
NanoDrop 3300 fluorospectrometer Thermo Scientific ND-3300
NTP Preparation
ATP Sigma-Aldrich  A6559
UTP Sigma-Aldrich  U1006
GTP Sigma-Aldrich  G3776
CTP Sigma-Aldrich  C9274
High Purity rNTPs GE Healthcare 27-2025-01
α-32P UTP  PerkinElmer   BLU007C001MC Radioactive compound
RNA ladder preparation 
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1–1 kb Millipore 69003
HEPES Sigma-Aldrich  H7006
Sodium chloride Sigma-Aldrich  S7653
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M8266
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
T7 RNAP Promega P2075
Gel preparation
Sequi-Gen GT nucleic acid sequencing cell  Bio-Rad   165-3804
Sigmacote   Sigma-Aldrich  SL2
urea   Sigma-Aldrich  U6504
tris(hydroxymethyl)aminomethane   Sigma-Aldrich  154563
boric acid  Sigma-Aldrich  B7901
ethylenediaminetetraacetic acid  Sigma-Aldrich  ED
40% Acrylamide/bis-acrylamide  Sigma-Aldrich  A9926
ammonium persulfate  Sigma-Aldrich  A3678
N,N,Nʹ′,Nʹ′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)  Sigma-Aldrich  T9281
N,N,N”,N”-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-Aldrich T9281
Transcription Assay
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
rifampicin   Sigma-Aldrich  R3501
formamide   Sigma-Aldrich  F9037
bromophenol blue  Sigma-Aldrich  B0126
xylene cyanol  Sigma-Aldrich  X4126
heparin  Sigma-Aldrich  84020
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2511
Transcription buffer 
Tris base Sigma-Aldrich  T1503
Potassium chloride Sigma-Aldrich  P9541
Magnesium chloride Sigma-Aldrich  M2393
DTT   Sigma-Aldrich  DTT-RO
glycerol   Sigma-Aldrich  G5516
Filter paper
Whatman 3MM Chr Chromatography Paper Fisher Scientific 05-714-5
Radioactive decontaminant
Decon 90 decon decon90
Gel Treatment
Typhoon Trio+ imager GE Healthcare Life Sciences 63-0055-89

References

  1. Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
  2. Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
  3. Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
  4. Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
  5. Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
  6. Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
  7. Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
  8. Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase?. Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
  9. Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
  10. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
  11. Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
  12. Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
  13. Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
  14. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
  15. Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
  16. Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
  17. Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
  18. Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
  19. Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
  20. Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
  21. Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).

Play Video

Cite This Article
Yang, X., Ma, C. In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery. J. Vis. Exp. (115), e54256, doi:10.3791/54256 (2016).

View Video