VacuSIP, um método melhorado para Inex<em> In Situ</em> Medição de partículas e dissolvidos compostos Processado por alimentadores de suspensão ativa

Alimentadores de suspensão bentônicos desempenham um papel essencial no funcionamento dos ecossistemas marinhos ^1. Ao filtrar grandes volumes de água ^2,3, eles removem e excretar partículas (plâncton e detritos) e compostos dissolvidos ¹ (e referências) e são um importante agente de acoplamento de ^4,5 bentônica-pelágica e ciclagem de nutrientes ^6,7. Com precisão medir a partículas e compostos dissolvidos removidos e excretados pelos alimentadores de suspensão bentônicas (como esponjas, ascídias, poliquetas, e bivalves) é fundamental para compreender a sua fisiologia, metabolismo e ecologia alimentar. Juntamente com bombeamento medições da taxa, ele também permite a quantificação dos fluxos de nutrientes mediadas por estes organismos e seu impacto ecológico na qualidade da água, bem como em processos de escala do ecossistema.

Escolhendo o método adequado para medir as taxas de remoção e produção de partículas e com dissolvidalibras por filtradores de suspensão é fundamental para a obtenção de dados fiáveis ​​sobre a sua atividade alimentar ^8. Como apontado por Riisgård e outros, inadequadas metodologias viés resultados, distorcer as condições experimentais, produzir estimativas incorretas de ingestão e excreção de certas substâncias, e pode levar à quantificação errônea dos fluxos de nutrientes processados ​​por esses organismos.

Os dois métodos mais utilizados para medir partículas e fluxos de nutrientes dissolvidos em alimentadores do filtro envolver a incubação (técnicas indiretas) ou cobrança simultânea de ambiente e água expirado (técnicas diretas). Incubação técnicas baseiam-se na medição da taxa de alteração da concentração de partículas e nutrientes dissolvidos na água incubadas, e estimar as taxas de produção ou remoção comparação com os controlos adequados ^8. No entanto, encerrando um organismo em uma câmara de incubação pode alterar a sua feeding e comportamento de bombagem devido a alterações no regime de fluxo natural, devido a uma diminuição em oxigénio e / ou na concentração de alimentos, ou devido à acumulação de compostos excreção na água de incubação ^7,9 (e suas referências). Em adição aos efeitos de confinamento e de abastecimento de água modificado, uma grande tendência de técnicas de incubação decorre de efeitos de re-filtração (ver por exemplo ^10). Embora alguns destes problemas metodológicos foram superadas, utilizando o volume direito e forma do recipiente de incubação ¹¹ ou com a introdução de um sistema de redoma de recirculação ¹² in situ, esta técnica muitas vezes subestima taxas de remoção e de produção. A quantificação do metabolismo de compostos dissolvidos tais como o azoto orgânico dissolvido (DON) e o carbono (DOC) ou nutrientes inorgânicos, tem provado ser especialmente propensos a erros causados ​​por técnicas de incubação ^13.

No final dos anos 60 e início dos anos 70, Henry Reiswig^9,14,15 foi pioneira na aplicação de técnicas diretas para quantificar remoção de partículas por esponjas Caribe gigantes, por amostragem separadamente a água inspirado e expirado pelos organismos in situ. Devido à dificuldade de aplicar a técnica de Reiswig em alimentadores de suspensão menores e em condições submarinas mais desafiadoras, a maior parte da investigação neste campo foi restrito ao laboratório (in vitro) empregando principalmente técnicas de incubação indiretos ^16. Yahel e colegas reaparelhado Reiswig do direta técnica in situ a trabalhar em condições de menor escala. Seu método, denominado Inex ^16, é baseado em amostragem subaquática simultânea da água inalado (In) e expirado (Ex) por organismos não perturbadas. A concentração diferente de uma substância (por exemplo, bactérias) entre um par de amostras (iNEX) proporciona uma medida da retenção (ou produção) de substância que pelo animal. A técnica Inex emprega tubos abertas ebaseia-se no jacto excurrente produzido pela actividade de bombeamento do organismo estudado para substituir passivamente a água ambiente no tubo de recolha. Enquanto Yahel e colegas aplicaram com sucesso esta técnica no estudo de mais de 15 suspensão alimentadores diferentes taxa (por exemplo, ^17), o método é limitado pelo alto nível de prática e experiência necessários, pelo tamanho minúsculo de alguns orifícios excurrentes, e por condições do mar.

Para superar esses obstáculos, desenvolvemos uma técnica alternativa baseada na sucção controlada da água amostrada através de tubos hora (diâmetro externo <1,6 mm). Nosso objetivo era criar um dispositivo simples, confiável e de baixo custo que permitiria limpo e controlado de amostragem de água situ a partir de um ponto muito específico, como o orifício excurrent de alimentadores de suspensão bentônicos. Para ser eficaz, o método tem de ser não-intrusivo, de modo a não afectar o regime de fluxo ambiente ou modificar o behavior dos organismos estudados. O dispositivo apresentado aqui é denominado VacuSIP. É uma simplificação do sistema desenvolvido pelo SIP Yahel et ai. (2007) ¹⁸ para amostragem por pontos baseado em ROV no fundo do mar. O VacuSIP é consideravelmente mais barato do que a SIP original e foi adaptado para o trabalho baseado em mergulho. O sistema foi projetado de acordo com os princípios apresentados e testados por Wright e Stephens (1978) ¹⁹ e Møhlenberg e Riisgård (1978) ²⁰ para ambientes de laboratório.

Embora o sistema VacuSIP foi concebido para estudos in situ do metabolismo dos alimentadores de suspensão bentônicos, ele também pode ser usado para os estudos de laboratório e onde é necessária, uma amostra de água de ponto fonte controlada e limpo. O sistema é especialmente útil quando a integração ao longo de períodos prolongados (mínimo de-horas) ou em filtrações in situ são obrigatórios. O VacuSIP tem sido utilizado com sucesso no laboratório Yahel desde 2011, e tem tambémsido empregado em dois estudos recentes de fluxos de nutrientes mediadas por espécies de esponjas das Caraíbas e Mediterrâneo ²¹ (Morganti et al. apresentado).

O uso de samplers específicas, a duração de amostragem prolongada, e as condições de campo, em que VacuSIP é aplicado, implicará alguns desvios protocolos oceanográficos padrão para coletar, filtrar, analisar e armazenar amostras de analitos sensíveis. Para reduzir o risco de contaminação pelo sistema VacuSIP ou o risco de modificação da água amostrada por actividade bacteriana após a recolha, foi testada em vários procedimentos de filtração e de armazenamento in situ. Diferentes dispositivos de filtragem, recipientes de recolha, armazenamento e procedimentos foram examinados a fim de alcançar a técnica mais adequada para a análise de dissolvido inorgânico (PO ₄ ^3-, NO _x ^-, NH ₄ ^+, SiO ₄₎ e orgânico (DOC + DON) compostos e ultra-plâncton (<1081; m) e partículas orgânicas (POC + PON amostragem). Para reduzir ainda mais o risco de contaminação, especialmente em condições de campo, o número de passos de manipulação foi reduzida ao mínimo. O formato visual no qual o método é apresentado é orientada para facilitar a reprodutibilidade e a reduzir o tempo necessário para aplicar a técnica de forma eficiente.

Visão geral do sistema

Para obter a amostra em água in situ bombeada de alimentadores de suspensão com orifícios exhalant tão pequenas quanto 2 mm, a actividade de bombagem de cada espécime é primeiramente visualizada através da libertação filtrada fluoresceína tingido água do mar junto ao orifício de inalação (s) e observando-se o seu fluxo a partir da abertura excurrente ¹⁶ (ver também a Figura 2B em ^18). A água inspirado e expirado pelo espécimen do estudo (incurrent e excurrentes) são então amostrados simultaneamente com a utilização de um par de tubos instalados na hora manipulador-construído sob encomenda ou em dois dos "ARMS "de um tripé portátil flexível de cabeça para baixo (Figura 1 e suplementares Vídeo 1). A água inalado pelo organismo estudo é recolhido por posicionando cuidadosamente a extremidade proximal de um tubo no interior ou perto da abertura de inalação do organismo estudo. Um idêntico tubo é então posicionado no interior do orifício excurrente. Esta operação requer o cuidado de evitar o contacto ou perturbação do animal, por exemplo, por ressuspensão do sedimento. para iniciar a amostragem, um mergulhador perfura um septo no recipiente de recolha com uma agulha de seringa ligado à extremidade distal de cada tubo, permitindo que a pressão de água externa para forçar a água amostrada para dentro do recipiente através do tubo de amostragem. a sucção é iniciada pelo vácuo criado previamente nos frascos e pela diferença de pressão entre a água externa e o recipiente da amostra evacuada .

Para garantir uma coleção de água limpa exalado e evitar aspiração acidental de ambiágua ent ^16, a taxa de amostragem da água deve ser mantida a uma taxa significativamente mais baixa (<10%) do que a taxa de fluxo excurrent. A taxa de sucção é controlada pelo comprimento do tubo e o seu diâmetro interno (ID). O diâmetro interno pequeno também garante um volume morto insignificante (<200 ul por metro de tubo). Recolha de amostras durante períodos prolongados (minutos a horas) faz com que seja possível integrar o patchiness inerente da maioria das substâncias de interesse. Para garantir que as amostras sejam adequadamente preservadas em sessões de amostragem subaquáticas prolongadas, bem como para o transporte para o laboratório, uma filtração em situ é recomendado para analitos sensíveis. A seleção dos vasos de amostragem, montagem de filtração, e tubos são ditadas pelos organismos de estudo e a questão de pesquisa específica. O protocolo descrito abaixo assume que um perfil metabólico completo é de interesse (para um resumo ver Figura 2). No entanto, a natureza modular do protocolo permite Fou modificação fácil para acomodar esquemas de amostragem simples ou até mesmo muito diferentes. Para um perfil metabólico completo, o protocolo de amostragem deve incluir os seguintes passos: (1) A visualização de fluxo; (2) alimentação amostragem ultra-plâncton (plâncton <10 mm); (3) A amostragem absorção de nutrientes inorgânicos e excreção (usando filtros em linha); (4) Amostra dissolvida absorção orgânica e excreção (usando filtros em linha); (5) a alimentação de partículas e excreção (usando filtros em linha); (6) Repita o passo 2 (alimentação ultra-plâncton como verificação de qualidade); (7) O fluxo de visualização.

Quando logisticamente viável, recomenda-se que as medições de perfil metabólicas são combinados com a taxa de bombeamento (por exemplo, o método a velocidade da frente de corante, em ^16), bem como com as medições de respiração. Estas medições são as melhores tomadas no início e no final da sessão de amostragem. Para a medição da respiração, optodes subaquáticas ou micro-eletrodos são preferíveis.