Summary

Um passo de purificação cromatográfica de Negativo<em> Helicobacter pylori</em> Neutrófilos-proteína de activação sobre-expresso em<em> Escherichia coli</em> Em Modo Batch

Published: June 18, 2016
doi:

Summary

Um método de alto rendimento para um passo de purificação negativa recombinante de Helicobacter pylori proteína activadora de neutrófilos (NAP-HP) sobre-expresso em Escherichia coli usando resinas dietilaminoetilo no modo de lote é descrito. HP-NAP purificada por este método é benéfico para o desenvolvimento de vacinas, medicamentos, ou diagnóstico de H. pylori -associated doenças.

Abstract

Helicobacter pylori proteína de activação de neutrófilos (HP-NAP) é um importante fator de virulência de Helicobacter pylori (H. pylori). Ela desempenha um papel crítico em H. pylori induzida por inflamação gástrica, activando vários leucócitos inatas, incluindo neutrófilos, monócitos, mastócitos e células. As propriedades imunogênicas e imunomoduladores da HP-NAP torná-lo um candidato potencial de diagnóstico e vacinas para H. pylori e uma nova droga candidatos para a terapia do cancro. A fim de obter quantidades substanciais de HP-NAP purificada utilizada para as suas aplicações clínicas, um método eficiente para purificar esta proteína com elevado rendimento e grau de pureza deve ser estabelecida.

Neste protocolo, nós descrevemos um processo para um passo de purificação cromatográfica negativa recombinante de HP-PNA sobre-expresso em Escherichia coli (E. coli) usando dietilaminoetilo resinas de permuta iónica (DEAE) (por ex., Sephadex) iModo lote n. Recombinante HP-NAP constitui quase 70% do total de proteínas em E. coli e é quase totalmente recuperada na fracção solúvel após a lise celular, a pH 9,0. Sob a condição óptima a pH 8,0, a maioria dos HP-NAP é recuperada na fracção não ligada enquanto as proteínas endógenas da E. coli são eficientemente removida pela resina.

Este método de purificação utilizando cromatograf ia em lotes modo negativo com resinas de permuta iónica em DEAE produz funcional HP-NAP a partir de E. coli, na sua forma nativa com elevado rendimento e pureza. A HP-NAP purificada pode ser ainda utilizado para a prevenção, tratamento e prognóstico do H. pylori -associated doenças, bem como a terapia do cancro.

Introduction

Helicobacter pylori (H. pylori) é uma das principais causas de gastrite e úlcera péptica. Esta bactéria também foi classificado como cancerígeno em humanos pela Agência Internacional para Pesquisa sobre o Câncer, parte da Organização Mundial da Saúde, em 1994. Estima-se que a prevalência de H. pylori é de 70% nos países em desenvolvimento e 30-40% nos países industrializados 1. Mesmo que a taxa de infecção de H. pylori está diminuindo nos países industrializados, a taxa de infecção de H. pylori em países em desenvolvimento ainda é alto 2. O tratamento padrão para erradicar H. pylori consiste na administração de um inibidor da bomba de protões, IPP, e dois antibióticos, amoxicilina ou claritromicina mais metronidazole 3. No entanto, o aumento da resistência aos antibióticos em H. pylori relacionados com a terapia de úlcera insta o desenvolvimento de novas estratégias para prevenir oR curar a infecção. O desenvolvimento de vacina preventiva e / ou terapêutica contra o H. pylori pode proporcionar uma abordagem alternativa para controlar H. pylori.

Helicobacter pylori proteína de activação de neutrófilos (HP-NAP), um importante fator de virulência do H. pylori, foi identificado pela primeira vez em extratos aquosos de H. pylori com a capacidade de activar os neutrófilos a aderir às células endoteliais e produzem espécies reactivas de oxigénio (ROS) 4. A infiltração de neutrófilos na mucosa gástrica encontrada em H. pylori pacientes infectados com gastrite ativa pode resultar em inflamação e danos nos tecidos do estômago. Assim, HP-PNA pode desempenhar um papel patológico através da activação de neutrófilos para induzir a inflamação gástrica, o que provoca ainda mais úlcera ou H. pylori -associated doenças gástricas. No entanto, HP-NAP é um candidato potencial para aplicações clínicas 5,6. Devido à pró imunogénica e imunomoduladorpriedades de HP-PNA, esta proteína pode ser utilizada para o desenvolvimento de vacinas, agentes terapêuticos, e ferramentas de diagnóstico. Um ensaio clínico foi conduzido para a utilização recombinante HP-NAP como um dos componentes de uma vacina contra a proteína H. pylori. Esta vacina consiste de recombinante HP-PNA, associado citotoxina-gene A (CagA), e proteínas citotoxina vacuolar A (VacA) formulado com hidróxido de alumínio e ainda tem sido demonstrado ser segura e imunogénica em humanos 7. Além disso, a HP-NAP actua como um potente imunomodulador para desencadear T auxiliar tipo 1 (Th1) -polarized respostas imunitárias para a terapia do cancro e 8 para regular negativamente as respostas imunitárias mediadas por Th2 provocadas por reacções alérgicas e infecções parasitárias 9,10. Como para o diagnóstico, com base ELISA-HP-NAP recombinante tem sido utilizada para a detecção de anticorpos séricos contra o HP-PNA em H. pylori pacientes infectados 11. Um estudo mostrou que o nível de anticorpos específicos de HP-NAP em soros de H. pyLori pacientes infectados com carcinoma gástrico foi significativamente mais elevada do que a partir de pacientes com gastrite crónica 12. Outro estudo também mostrou que os anticorpos séricos contra HP-PNA estão associados com a presença de não-cárdia adenocarcinoma gástrico 13. Assim, ELISA baseado em HP-NAP recombinante pode ser utilizada para a detecção de anticorpos séricos contra o HP-PNA para o prognóstico do cancro gástrico em H. pylori pacientes infectados. Tomados em conjunto, o HP-NAP purificada pode ser ainda utilizado para a prevenção, tratamento e prognóstico do H. pylori -associated doenças, bem como a terapia do cancro.

Entre os vários métodos utilizados para a purificação do HP-NAP recombinante expressa em Escherichia coli (E. coli) na sua forma nativa relatados até agora, uma cromatograf ia de filtração em gel segundo passo de purificação envolvendo é necessária para se obter elevada pureza HP-NAP 14-16 . Aqui, um método utilizando a cromatografia modo descontínuo com negativodietilaminoetilo (DEAE) resinas de permuta iónica é descrito para a purificação do HP-PNA sobre-expresso em E. coli com elevado rendimento e elevada pureza. Esta técnica de purificação foi baseado na ligação de proteínas e / ou que não sejam HP-PNA para a resina de impurezas da célula hospedeira. A pH 8,0, quase sem outras proteínas, exceto HP-NAP são recuperados a partir da fracção livre. Esta abordagem purificação utilizando cromatografia de troca iônica DEAE no modo negativo é simples e economia de tempo, permitindo a purificação do recombinante HP-NAP através de cromatografia de uma etapa, através da recolha da fracção livre. Além de HP-PNA, várias outras biomoléculas, tais como vírus 17, Imunoglobulina G (IgG) 18, hemoglobina 19, fosfatase de proteína 20, e factor de virulência flagelina 21, também tem sido relatado para ser purificado por cromatografia de permuta iónica em negativo modo. O modo negativo é o preferido para a cromatografia de permuta iónica se as impurezas são o menorcomponentes presentes na amostra submetida a ser purificada 22. A aplicação de cromatografia negativa em purificação de biomoléculas naturais ou recombinantes foi recentemente revista 23.

O presente relatório fornece um passo a passo de protocolo para a expressão de recombinante HP-NAP em E. coli, a lise das células, e a purificação do HP-PNA utilizando cromatografia lote modo negativo com resinas de permuta iónica em DEAE. Se uma proteína desejada para a purificação é adequada para cromatografia de permuta iónica em modo negativo, o protocolo descrito também pode ser adaptado como um ponto de partida para o desenvolvimento de um processo de purificação.

Protocol

O sangue humano foi coletado de voluntários saudáveis ​​com o consentimento informado por escrito antes e aprovação do Conselho de Revisão Institucional da Universidade Nacional Tsing Hua, Hsinchu, Taiwan. 1. Expressão Recombinante de HP-PNA em E. coli Prepara-se o plasmídeo pET42a-PNA contendo a sequência de ADN de HP-NAP de H. pylori 26695 estirpe como descrito anteriormente 16. Prepare os plasmídeos contendo a sequência de ADN de HP-NAP com as mutações p…

Representative Results

O diagrama esquemático do processo experimental de purificação negativa recombinante de HP-NAP expressa em E. coli, usando resinas de permuta iónica em DEAE em modo de lote é mostrado na Figura 1. Esta técnica de purificação é baseado na ligação de proteínas e / ou que não sejam HP-PNA para a resina de impurezas da célula hospedeira. A pH 8,0, quase sem outras proteínas, exceto HP-NAP na sua forma nativa são recuperados a partir da fracção não…

Discussion

A cromatografia em lote modo negativo com resinas de permuta aniónica DEAE aqui apresentado é adequado para a purificação do recombinante HP-NAP sobre-expressos em E. coli. Os valores dos tampões utilizados nos passos de lise de células e purificação de pH são muito crítica para assegurar a solubilidade de HP-PNA em E. Os lisados ​​de E. coli e a separação eficiente de recombinante HP-NAP a partir de impurezas da célula hospedeira, respectivamente. As células bacterianas lisa…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Chao-Sheng Cheng at National Tsing Hua University, Taiwan, for performing the circular dichroism measurement. We also thank Drs. Evanthia Galanis and Ianko D. Iankov at Mayo Clinic, USA, for providing the anti-HP-NAP monoclonal antibody. We appreciate Drs. Han-Wen Chang and Chung-Chu Chen at Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for providing advice for IRB application, Mr. Te-Lung Tsai at the Mackay Memorial Hospital, Hsinchu, Taiwan, for supervising the analysis of isolated neutrophils, and Ms. Ju-Chen Weng at National Tsing Hua University, Taiwan, for her technical assistance. This work was supported by grants from the Ministry of Science and Technology of Taiwan (MOST 104-2311-B-007-003, NSC101-2311-B-007-007 and NSC98-2311-B-007-006-MY3), the Joint Research Program of National Tsing Hua University and Mackay Memorial Hospital (100N7727E1, 101N2727E1, 103N2773E1), and the research program of National Tsing Hua University (104N2052E1).

Materials

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Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare Life Sciences 17-1440-02 for density gradient centrifugation to purify human neutrophils
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Flat bottom 96-well white plate Thermo Fisher Scientific Inc 236108 http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-f96-microwell-black-white-polystyrene-plate.html
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Cite This Article
Kuo, T., Hong, Z., Tsai, C., Yang, Y., Fu, H. One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode. J. Vis. Exp. (112), e54043, doi:10.3791/54043 (2016).

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