Conversión epigenética como un método seguro y simple para obtener células secretoras de insulina a partir de fibroblastos de la piel de adultos
Summary
Here, a new method that allows the conversion of adult skin fibroblasts into insulin-secreting cells is presented. This technique is based on epigenetic conversion, does not involve the use of retroviral vectors nor the acquisition of a stable pluripotent state. It is therefore highly promising for translational medicine applications.
Abstract
Regenerative medicine requires new, fully functional cells that are delivered to patients in order to repair degenerated or damaged tissues. When such cells are not readily available, they can be obtained using different approaches that include, among the many, reprogramming and trans-differentiation, with advantages and limitations that are specific of the different techniques. Here a new strategy for the conversion of an adult mature fibroblast into an insulin-secreting cell, arbitrarily designated as epigenetic converted cells (EpiCC), is described. The method has been developed, based on the increasing understanding of the mechanisms controlling epigenetic regulation of cell fate and differentiation. In particular, the first step uses an epigenetic modifier, namely 5-aza-cytidine, to drive adult cells into a “highly permissive” state. It then takes advantage of this brief and reversible window of epigenetic plasticity, to re-address cells toward a different lineage. The approach is designated “epigenetic cell conversion”. It is a simple and robust way to obtain an efficient, controlled and stable cellular inter-lineage switch. Since the protocol does not involve the use of any gene transfection, it is free of viral vectors and does not involve a stable pluripotent state, it is highly promising for translational medicine applications.
Introduction
Un objetivo fundamental de la medicina regenerativa es la generación de células nuevas y funcionales que se pueden utilizar para reparar o reemplazar dañado, degenerado tejidos. Rehacer células adultas fácilmente disponibles en otros nuevos, mediante la conversión de un tipo de célula a otra, es un enfoque particularmente atractivo, especialmente cuando la población de células requerido no es abundante o de difícil acceso. Sin embargo, las células adultas son extraordinariamente estables. Adquieren su estado diferenciado a través de una restricción gradual en sus opciones y, una vez que lleguen a la terminal de especialización madura, que se retengan de manera estable 1.
En los últimos años se han desarrollado una serie de protocolos, que permitan la reasignación a la pluripotencia de una célula somática (iPS) logrado a través de la expresión forzada de un conjunto de factores de transcripción 2,3. Alternativamente, la conversión de células puede obtenerse por transdiferenciación linaje directo, la introducción de un solo 4 </sup> o una combinación de factores de transcripción 5-7. Esta estrategia no implica la transición a través de un estado de-diferenciado, pero sí requiere una alta expresión de los factores de la transcripción específica 8.
Hemos desarrollado recientemente un protocolo de conversión basado en la breve exposición de las células adultas a las propiedades de desmetilación del análogo de citidina 5-azacitidina (5-aza-CR), un inhibidor de la metiltransferasa de ADN bien caracterizado. La etapa de desmetilación es seguido inmediatamente por un protocolo de diferenciación específica 9-11 que permite obtener el fenotipo de terminal requerida. Este método es capaz de convertir células maduras, diferenciadas en células de un linaje diferente y tiene la ventaja sustancial para evitar tanto el uso de vectores virales y la transfección de los factores de transcripción exógenas. La adquisición de un estado pluripotente estable, y el aumento de la susceptibilidad relacionada con la inestabilidad celular también se evita.
<p class="Jove_content"> El protocolo detallado que permite la conversión de fibroblastos de piel humana adultas en células completamente funcionales secretoras de insulina se presenta aquí. Sin embargo, vale la pena señalar que la técnica se ha aplicado a diferentes tipos de células y ha generado resultados positivos, al dirigirse a células hacia diferentes vías de diferenciación. Además, la conversión epigenética se ha utilizado con éxito en la especie humana y porcina 9-13, así como en el perro (manuscrito presentado) lo que sugiere una amplia eficacia y la robustez de la aproximación.Protocol
Representative Results
Discussion
El presente manuscrito describe un método que permite la conversión de fibroblastos de piel humana en células productoras de insulina, a través de una exposición transitoria y breve a 5-aza-CR, seguido de un protocolo de inducción específica de tejido. Este enfoque permite un interruptor del mesodermo a las células relacionadas con endodermo, sin la expresión forzada de factores de transcripción o microRNAs ni la adquisición de un estado pluripotente estable, que hace que las células más inestable y propens…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación Carraresi y la Fundación Europea para el Estudio de la Diabetes (EFSD). GP es apoyado por una beca post-doctoral de la Universidad de Milán. Los autores son miembros de la Acción COST FA1201 Epiconcept: Epigenética y periconcepción medio ambiente y la Acción COST avanza en modelos animales grandes BM1308 Sharing (Salaam). TALB de es miembro de la Acción COST CM1406 epigenética Biología Química (EPICHEM).
Materials
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D5652 | PBS; for cell wash and solution preparation |
| Antibiotic Antimycotic Solution | Sigma | A5955 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| 100 mm petri dish | Sarstedt | 83.3902 | For Fibroblast isolation |
| Porcine Gelatin | Sigma | G1890 | For dish coating |
| Water | Sigma | W3500 | For solution preparation |
| 35 mm petri dishes | Sarstedt | 83.39 | For Fibroblast isolation |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 41966052 | For Fibroblast culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10500064 | FBS; Component of Fibroblast and HP media |
| L-Glutamine solution | Sigma | G7513 | Component of Fibroblast, HP and Pancreatic media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | For Fibroblast dissociation |
| KOVA GLASSTIC SLIDE 10 WITH GRIDS | Hycor Biomedical | 87144 | Cell counting |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385 | 5-aza-CR, for increrase cell plasticity in fibroblasts |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Life Technologies | 31550031 | For HP medium |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Life Technologies | 31885023 | For HP medium |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | Component of HP medium |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life Technologies | 11140035 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | Component of HP and Pancreatic Basal media |
| Guanosine | Sigma | G6264 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Adenosine | Sigma | A4036 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Cytidine | Sigma | C4654 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Uridine | Sigma | U3003 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Thymidine | Sigma | T1895 | Nucleoside mix stock component of HP medium |
| Millex-GS 0,22 µm | Millipore | SLGS033SB | For sterilizing of solution |
| FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG0261 | bFGF; Component of HP and Pancreatic Basal medium |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | BSA; Component of Pancreatic Basal medium |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320074 | For Pancreatic Basal medium |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A | Life Technologies | 12587010 | Component of Pancreatic medium |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | Component of Pancreatic Basal medium |
| Activin A Recombinant Human Protein | Life Technologies | PHG9014 | For Pancreatic medium |
| Retinoic Acid | Sigma | R2625 | For Pancreatic medium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | DMSO; for Retinoic Acid stock preparation |
| Insulin-Transferrin-Selenium | Life Technologies | 41400045 | ITS; for Pancreatic Final medium |
| Anti-Vimentin antibody | Abcam | ab8069 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma | 32670 | DAPI. For immunocytochemical analisys. Working dilution 1µg/ml |
| 5-Methylcytidine | Eurogentec | MMS-900P-B | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Anti-C Peptide antibody | Abcam | ab14181 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:100 |
| Anti-PDX1 antibody | Abcam | ab47267 | For immunocytochemical analisys. Working dilution 1:500 |
| Mercodia Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-10 | For insulin release detection |
References
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