细胞色素封装<em>ç</em>在二氧化硅气凝胶Nanoarchitectures没有金属纳米粒子，同时保持气相生物活性

安全眼镜或护目镜，实验室大衣和实验室手套在所有时间过程中被磨损。不要在没有安全眼镜或护目镜操作临界点干燥设备。含四甲氧基硅烷，甲醇，乙醇，丙酮和氨水所有解决方案应在通风橱内进行处理。 1.缓冲和细胞色素。Ç解决方案让〜750毫升pH为7，40 mM磷酸钾缓冲液中，首先通过称量出2.72克磷酸二氢钾并使用500ml的容量瓶中溶解在水中制成500毫升之0.04M的磷酸二氢钾。 通过称出3.48克磷酸氢二钾的并使用500ml的容量瓶中溶解在水中制成500毫升之0.04M的磷酸氢二钾的。 倾二元盐溶液放入大烧杯有搅拌棒，并开始搅拌在搅拌盘的溶液。 慢慢加入的一元盐S部分olution到二元盐溶液中，同时监测pH用pH电极和计直到pH为7.00。约250-300毫升的单碱式盐溶液将被使用。 称取玻璃闪烁瓶约0.023克CYT。c和地点。添加使用微量制备的磷酸钾缓冲液2,000微升，然后轻轻摇动该溶液混合，直到所有的固体，红细胞色素的。C具有溶解到溶液中，并没有颗粒物质存在。 取20微升制备的细胞色素。C溶液并加入到1-cm光程塑料杯中。加入3 ml准备好的缓冲。 在基准单元用缓冲采取紫外可见光谱，从300-700纳米。以106100 M -1 -1 409纳米，消光系数31（ε）使用细胞色素。C吸收（A）中，反应杯路径长度（L），和比尔-朗伯定律来确定浓度（C）该解决方案的（A =εlc）。 回到计算原始制备的溶液的浓度。该混合制得细胞色素。C溶液典型地在浓度0.7毫之间至0.9。 吹打117微升0.72毫准备CYT。C溶液变成闪烁瓶中稀释原准备CYT，C溶液800微升0.105毫米的。然后加入制备缓冲的800微升（683微升在这种情况下）的平衡。涡流混合。确切的量将根据原始制备细胞色素的确切浓度c到吸移管被作为（800微升* 0.105毫摩尔）计算而改变。C溶液作为细胞色素的体积。/（原始细胞色素。在4.0mm的C浓度）。 在冰箱在2-8℃下保存原来的准备和稀释细胞色素。ç解决方案，直到准备使用长达两个星期。 2.合成二氧化硅（SiO 2）的溶胶标签一次性50毫升聚丙烯烧杯“要阿克尔A'。放置在分析天平上的摇动烧杯中，并用玻璃巴氏吸管1.88克四甲加入到烧杯中。零余额，然后吸取2.88克甲醇为“烧杯”。 封面“烧杯”封口膜。 标签一次性50毫升聚丙烯烧杯“烧杯B'。添加磁性搅拌棒和地点在分析天平上的锅。使用玻璃吸管来添加0.75克水和3.00克甲醇。 封面“烧杯B'封口膜。 开始搅拌在通风柜内部的搅拌板“烧杯B'中的内容，然后用注射器插入5微升的28.0-30.0％的氢氧化铵溶液通过封口膜覆盖到混合物中，同时进行搅拌。 只要步骤2.5完成后，“烧杯A”的内容添加到'烧杯B'搅拌该混合物20分钟，同时覆盖封口膜。 3.准备凝胶模具注意：是时间，而该硅溶胶混合物在步骤2.6搅拌以制备凝胶的模具。 获得8-9聚丙烯闪烁瓶（16毫米×57毫米音量大小6.5毫升，与底部切掉）和相应的上限。放保鲜膜在小瓶的帽端以创建一个平坦表面的凝胶，以形成上和放置在盖在它确保保鲜膜撑帽内不变。 线向上与帽式小瓶倒在工作台上，打开底部朝上。 4.准备色素。ç -二氧化硅溶胶-凝胶经溶胶混合（步骤2.6）完成后，加入3毫升溶胶混合到一个干净的一次性50毫升聚丙烯烧杯中。 使用玻璃巴斯德吸管缓慢下降500微升的0.105毫米稀释细胞色素。C溶液（步骤1.9 ​​制造）超过约1分钟的过程3ml的溶胶的混合物。确保轻轻地旋转混合物，同时加入细胞色素c。要避免形成大红色的团块。假设卷是添加剂，稀释500微升0.105毫细胞色素。C溶液的至3500微升，现在在溶胶是细胞色素。C的浓度，在理论上，15微米。 吸管将0.5ml所得的细胞色素。Ç硅溶胶到每个准备好的模具。还吸取0.5毫升其余'纯'硅溶胶成一个或两个模具在超临界干燥过程作为对照样品来使用。 覆盖用Parafilm模具的面朝上的开口，并把在冰箱（〜2-8℃）过夜或至少12小时，以产生溶胶 – 凝胶。 就拿出来模具冰箱。从包含CYT一个模具的顶部取下封口膜Ç溶胶-凝胶。还请从下方盖和塑料包装。 从洗瓶加入一些乙醇倒入模具后，用注射器活塞的圆盘结束小心地将凝胶从模具中，并倒入干净加入20毫升玻璃闪烁瓶续癌宁大约5毫升乙醇。 重复此凝胶去除过程（步骤4.5和4.6），直到所有的细胞色素的。Ç凝胶加入到小瓶中，并全部硅胶加入到单独的管形瓶中。如果CYT。ç凝胶多个浓度已经做出，一定要分开的小瓶中存放在一起像凝胶。然后填写小瓶与2-8°C之间乙醇，帽子和存储的顶部。 每四小时全天，从冰箱取出凝胶，倒出乙醇落凝胶并用新鲜乙醇替换。 期间另外处理三天，浸没在丙酮湿溶胶凝胶，倾析并加入新鲜的丙酮，一天三次。 5.超临界干细胞色素。ç -二氧化硅溶胶-凝胶由连接的环行器的温度设定至8℃冷却的临界点干燥装置（ 见图1），以10℃。 一旦该装置具有r个eached 10℃，通过填充转印船用丙酮和密封它的装置内执行对装置的泄漏测试。 打开装置的填充阀并加入二氧化碳直至该装置是半满。 关闭进水阀，并认真听取了在门和阀门，其中O型圈密封，或可能会恶化嘶嘶。 如果泄漏被发现更换所有O型圈或者盖章。 在完成泄漏测试之后，打开排水阀以释放丙酮和二氧化碳转化为一个通风橱的漏极。然后，从装置中取出传送舟。 确保设备无泄漏后，小心地倒在闪烁瓶湿凝胶，与大多数丙酮，到转会船的三大段长沿（样本篮子或纱布盖是不是必要的）。微妙推并与钳舟内移动的凝胶，以确保所有的凝胶完全浸没我ñ丙酮。如果需要，密封船上的设备内部之前添加更多丙酮。 打开装置的充水阀以添加二氧化碳，然后打开排水阀，只要丙酮与二氧化碳混合，观察到通过设备窗口被下沉到该装置的底部释放丙酮五分钟。会发生丙酮此渗滤到前下方的装置完全充满二氧化碳，所以填充阀应该保持开放到排水的过程中所需的程度，使得该装置将继续填充即使在漏极是开放的。 关闭排水阀。保持裂了开来稍微进水阀。 五分钟后，打开排水阀五分钟一次调整填充阀以使该装置保持在整个排水时间充分要足够打开。关闭排水阀，保持进水阀裂了开来，然后重复此排水一步一个更多时间的五分钟后。 以下这些前三个排水步骤中，打开5分钟的漏极在时间大约每40分钟以上的至少6小时的跨度，以确保由液体二氧化碳在凝胶内完全替换丙酮中。总是调整填充阀各排水过程中有足够的开放，使得在装置中的液面排出期间从不低于船的顶部。 一旦排水步骤后，关闭进水阀，以及使电平通过设备窗户看只是船上的插脚上面仍然可见排出液态二氧化碳。 该装置连接的环行器的温度设定为40℃，以确保在液体二氧化碳升高高于其临界温度和压力（T C = 31°C，P C = 7.4兆帕）。 后约15分钟，通过设备窗口作为液体menisc观察从液体到超临界流体的过渡我们在船的叉以上消失。允许的平衡时间至少15分钟，然后打开放空阀少量开始释放超临界流体。 在大约45分钟的过程中，继续逐步打开排气阀越走越宽，使释放流体的稳定，但非常低的嘶嘶声可闻及观察压力表缓慢降低至零。 该装置的压力已经到零后，打开装置的门，取出舟，并使用镊子来放置新干燥气凝胶在干净的玻璃闪烁瓶中。 6.检定色素。ç -二氧化硅气凝胶，用紫外-可见和圆二色（CD）光谱准备一个纸板平台保持气凝胶整料在紫外可见分光光度计或CD分光计的光束路径。 切出2.5cm的×2.5cm的片轻质纸板（如从LABO一盒纸板ratory组织），对折，切半山腰上折，再对折了两片，通过削减创建的，回来了。 切出5厘米×5厘米长的轻量级纸板，在中间1.5×1.5cm的方孔。然后使用黑色电胶带到保持的尺寸减小至0.5cm×0.5厘米胶带使小弯曲表面为气凝胶整料创建针对5厘米×5厘米长纸板的折叠和切割纸板的折翼以直接在0.5厘米×0.5厘米的洞的前面坐（参见图2） 。然后用胶带的紫外可见分光光度计背面一块纸板所以孔是在与束路径线。 测量凝胶，这将被用于路径长度，用千分尺的厚度。 放置纸板平台上的一个凝胶和从在紫外可见分光光度计的基准室与空气300-800毫微米测量的光谱。 适合多项式，A = A </青霉>λn，用来对波长（λ）区，其中所述吸光度（A），主要是由于背景散射，〜700-800纳米。的一个系数是通常适合之间的数〜1×10 8 1×10 6和n个系数是通常配合到2号和3之间〜。 计算散射在其它波长，采用的系数，A和n，从拟合获得。 减去从原始光谱这个计算散射背景吸收获得散射光谱校正。 适合用在370的区域中的高斯曲线散射减去频谱使用适当的软件（GRAMS / AI 8.0），以确定峰高，峰中心，和气凝胶的索瑞峰的峰宽490纳米。 使用凝胶的测得的厚度为路径长度（L），的106100 M中的消光系数31（ε）应用比尔-朗伯定律-1 -1 </SUP>和索瑞峰高（A）来计算气凝胶（A =εlc）CYT，C的浓度（C）。 C的浓度比较计算出的细胞色素。向浓缩理论上在凝胶（15微米），以确定该气凝胶内细胞色素。C的生存能力。典型百分之存活率接近100％，但应该指出的是，这些存活率只是估计，因为计算是基于在溶液中31细胞色素。Ç这被推定为比细胞色素的消光系数略有不同的消光系数。 c。在不知道的气凝胶。 在CD仪器至少5分钟运行氮气接通灯之前。 用胶带将纸板支架到CD分光计所以孔是在与束路径线。 在100纳米/分测量与纸板支架没有从350-500纳米连续波长空白频谱，取三次扫描的平均。 放置纸板平台上的一个凝胶（先前在步骤6.2测得的厚度），并在100纳米/分钟测量从350-500纳米光谱，服用的三次扫描的平均值。 重复紫外可见和CD测量所有感兴趣的气凝胶单块。 7.检测一的存在氧化氮（NO）气体与细胞色素。Ç -二氧化硅气凝胶注意：由于没有工作是危险的，根本没有气体应在通风橱处理或排放到通风橱。持续暴露于否是有毒的组织作为剧毒二氧化氮和/或四氧化二氮时否开始与空气接触将形成。当否开始与水接触时的热和腐蚀性烟雾也生产。 放置一个8升的一氧化氮气缸（10％的一氧化氮，90％的氮）在通风良好的通风橱并调节压力至4磅。 连接管连接到两个氧化氮汽缸和一个氮气缸（压力设置为6 ps的i）和连接起来的管道，以T型阀的端部（参见图3a）。 选择用于实验的气凝胶整料和测量的厚度（或路径长度）用千分尺。 放置在与塑料盖的一次性比色皿气凝胶（〜3mm厚），并把反应杯放入分光光度计。切气凝胶略微如果需要，以适应在反应杯中。 插入两个注射器的针插入反应杯的塑料帽，一个连接到T型阀的输出，和一个连接到一个管子用作排气进入通风柜（参见图3b）。用封口膜向针密封到管和盖的试管中。 放置在参考单元的空的一次性杯中。 调整气凝胶反应杯的位置以确保该气凝胶开始实验之前在于光束路径。 取的初始光谱从800至300纳米。 监测在4吸光度之间的​​差14纳米，并在408处的吸光度而转动T型阀以设定的时间间隔，确保在任何时候是氮或氧化氮/氮气混合物如此之高，流量的氮和一氧化氮/氮气混合物之间进行切换气凝胶中的反应杯移到周围。 取的最终光谱从800至300纳米，一旦曝光周期结束。 重复该过程具有三个至4个整料以获得平均检测响应。