Summary

Un método simplificado para determinar la densidad ultra-baja, a largo plazo del hipocampo primaria Neurona Cultura

Published: March 05, 2016
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Summary

Low density cultures of primary hippocampal neurons usually require glia feeder layer to supply neurotrophic factors and sustain longevity. We describe here a simplified method to culture ultra-low density neurons on glass coverslips in the presence of a high density neuronal feeder layer, which facilitates investigation of specific neuronal-autonomous mechanisms.

Abstract

El cultivo de neuronas del hipocampo primaria in vitro facilita el interrogatorio mecanicista de muchos aspectos del desarrollo neuronal. Disociadas las neuronas del hipocampo embrionarias a menudo pueden crecer con éxito en cubreobjetos de vidrio a alta densidad en condiciones libres de suero, pero los cultivos de baja densidad normalmente requieren un suministro de factores tróficos por ellos co-cultivo con una capa de alimentación glia, la preparación de los cuales puede llevar mucho tiempo y laborioso. Además, la presencia de glia puede confundir la interpretación de los resultados y los estudios se oponen sobre los mecanismos específicos de neuronas. A continuación, se presenta un método simplificado de ultra-baja densidad (~ 2.000 neuronas / cm2), a largo plazo (> 3 meses) la cultura de las neuronas del hipocampo primaria que se encuentra bajo condiciones libres de suero y sin apoyo de células glia. neuronas de baja densidad se cultivan en cubreobjetos recubiertos con poli-D-lisina, y se volcó en las neuronas cultivadas de alta densidad en una placa de 24 pocillos. En lugar de utilizar puntos de parafina para crear un espacio between las dos capas neuronales, los experimentadores pueden simplemente grabar el fondo de plástico del pozo, en el que residen las neuronas de alta densidad, para crear un microespacio propicio para el crecimiento de las neuronas de baja densidad. El co-cultivo puede ser mantenido fácilmente durante> 3 meses sin pérdida significativa de neuronas de baja densidad, lo que facilita el estudio morfológico y fisiológico de estas neuronas. Para ilustrar esta condición de cultivo exitoso, se proporcionan los datos para mostrar la formación de sinapsis profusa en las células de baja densidad después del cultivo prolongado. Este sistema de co-cultivo facilita también la supervivencia de las neuronas individuales dispersas cultivadas en islas de sustratos de poli-D-lisina y por lo tanto la formación de conexiones autaptic.

Introduction

Cultivo de neuronas del hipocampo en condiciones in vitro permite la observación y la manipulación experimental de estas neuronas que de otra manera no son posibles en vivo. Este enfoque experimental es ampliamente utilizado para revelar los mecanismos neuronales de crecimiento, la polaridad, la especificación de neuritas, el tráfico y la localización subcelular de las proteínas, la formación de sinapsis y la maduración funcional 1. Estos in vitro neuronas del hipocampo en cultivo, cuando se cosecha a partir de las últimas etapas embrionarias, son relativamente puro (> 90%) de las células glutamatérgicas de la morfología piramidal 2. Debido a que las neuronas se cultivaron en una superficie de 2-D en condiciones in vitro, este método permite la observación fácil, tales como formación de imágenes en vivo o inmunocitoquímica (ICC) tinción a través de un único plano focal 3; o manipulaciones, como el tratamiento de drogas y transfecciones 3-6. Cuando se cultiva a alta densidad, las neuronas tienden a tener altas tasas de supervivencia a causa de una mayor cooperaciónncentrations de factores de crecimiento secretados además de apoyo alimentario a partir de los medios de crecimiento, y también debido a los mecanismos dependientes del contacto neuritas 7. Sin embargo, las neuronas del hipocampo de baja densidad son deseables para los estudios morfológicos, donde una neurona individual se pueden obtener imágenes en su totalidad o teñido para el análisis de la CPI. Neuronas de baja densidad son difíciles de mantener en cultivo debido a la falta de apoyo paracrina y por lo tanto a menudo requieren soporte trófico de un glial (típicamente cortical astrocitos) capa de alimentación, que tiene que ser preparada antes del cultivo de las neuronas 2. Cuando se co-cultivaron con una capa de alimentación de células gliales, las neuronas de baja densidad se cultivan en cubreobjetos, y luego da la vuelta en la parte superior de la capa de células gliales de modo que las neuronas de baja densidad y glia se enfrentan entre sí. Un pequeño espacio confinado entre la glía y las neuronas se crea mediante la colocación de puntos de cera de parafina en las esquinas de los cubreobjetos, por lo tanto la creación de un diseño de "sandwich" 2,8,9. Las neuronas de baja densidad crecerán wentro del espacio confinado entre glia y el cubreobjetos, que crea un microambiente permisiva con factores concentrados secretadas por las neuronas y células gliales. Este enfoque produce baja densidad, las neuronas plenamente desarrollados que están espaciados aparte razonable, por lo tanto, facilitar el etiquetado de la CPI o estudios de imagen en vivo.

Un inconveniente evidente de co-cultivo neurona-glía, además de ser lento y laborioso, es que evita estudio de específicos de neuronas, o células autónomas, mecanismos. Aunque este sistema es mucho menos complejo que in vivo el tejido neural, células gliales impacto sobre el desarrollo de las neuronas a través de factores definidos, que aún no es totalmente segregadas pueden confundir a los experimentos 10. Por lo tanto, en los experimentos que requieren la investigación de mecanismos específicos de neuronas, las condiciones de cultivo definidos que eliminar el suero y la capa de apoyo glial son necesarios. Un estudio previo ha tenido éxito en el cultivo de bajas concentraciones de neuronas (~ 9.000 células / cm 2) usando un THmatriz de hidrogel dimensiones ree 11. Desde una población neuronal relativamente puro puede cultivarse a alta densidad en condiciones libres de suero sin apoyo glial, que postula que ultra-baja densidad de neuronas del hipocampo se puede cultivar en suero libre definido medio de cultivo por los co-cultivo con las neuronas de alta densidad, en de una manera que es análoga a la neurona-glía co-cultivo convencionalmente adoptado. De hecho, la alta densidad de las neuronas del hipocampo culturas en una configuración de "sandwich" se han utilizado recientemente para apoyar a un pequeño número de neuronas magnocelular endocrinas especializadas 12.

Por lo tanto, co-cultivo con las neuronas de alta densidad puede permitir que las neuronas de baja densidad que reciben apoyo factores tróficos que es suficiente para permitir la supervivencia a largo plazo. Este protocolo de neuronas ultra-baja densidad de cultivo fue así formulado y validado. El protocolo puede implementarse dentro de un único experimento, mediante la preparación de alta densidad (~ 250.000 células / ml) dislas neuronas del hipocampo no asociados primero, y luego hacer una dilución para producir una densidad de ~ 10.000 neuronas / ml (~ 3.000 neuronas / cubreobjetos, o ~ 2.000 neuronas / cm 2), que es mucho más bajo que la mayoría informó de cultivos de baja densidad 2,3,9 , 11,13. Esta condición se conoce la cultura libremente como cultura "ultra-baja densidad 'y se utiliza con" baja densidad "de manera intercambiable. Las neuronas de alta densidad se colocan en el poli-D-lisina placas de 24 pocillos recubiertas; mientras que las neuronas de baja densidad se siembran en cubreobjetos de vidrio de 12 mm recubiertos con poli-D-lisina que se colocan dentro de otra placa de 24 pocillos. Los cubreobjetos con adherir neuronas de baja densidad se da la vuelta en la parte superior de las neuronas de alta densidad 2 horas más tarde después de que las neuronas se descienden y se unen a los cubreobjetos. Además, en lugar de utilizar puntos de cera de parafina para elevar los cubreobjetos por encima de la capa de neuronas de alta densidad, se utilizó una aguja de jeringa de 18 G para grabar la parte inferior de las placas de 24 pocillos con dos franjas paralelas. El resultado MostrAced, plásticos adyacentes proporcionar un soporte elevado para los cubreobjetos de vidrio. Este espacio se mide constantemente a 150-200 micras, lo que permite suficiente intercambio de oxígeno y medio de cultivo al tiempo que proporciona un microambiente con factores tróficos concentradas. Bajo esta condición, las neuronas de baja densidad crecen mucho, y pueden sobrevivir más allá de tres meses en cultivo. Cuando estas neuronas son transfectadas con el plásmido GFP después de tres semanas de cultivo, las dendritas están profusamente salpicado de espinas dendríticas. Como prueba de principio, los datos se presentan para mostrar que este sistema de co-cultivo apoya culturas ultra-baja densidad de neuronas del hipocampo sembradas en poli-D-lisina 'micro-islas', donde las neuronas forman conexiones autaptic que pueden facilitar la investigación de células , mecanismos independientes de la red -autonomous.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales con ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Arizona, y se ajustaban a las directrices del NIH. 1. El tejido del hipocampo Fuente de Neurona Cultura Para generar crías prenatales de ratón para el cultivo de neuronas del hipocampo, utilizar ratones en tiempo de embarazo (C57Bl6 / J) que se crían en la casa 17. Al día con la detección del tapón vaginal se designa c…

Representative Results

El protocolo descrito aquí permite éxito densidad ultra-baja, cultivo a largo plazo de las neuronas glutamatérgicas puro sin la necesidad de células de la glia que actúa como una capa de alimentación. El protocolo se esquematiza en la Figura 1, que implica la preparación de alta densidad (en poli-D-lisina recubierto de 24 pocillos) y las neuronas de baja densidad (en cubreobjetos de vidrio recubiertos con poli-D-lisina) por separado, y la posterior co-cultivo que …

Discussion

Se presenta un protocolo detallado para el cultivo a largo plazo de ultra baja densidad de neuronas glutamatérgicas del hipocampo en condiciones libres de suero. En 2000 ~ neuronas / cm2, la densidad es al menos dos veces menor que la mayoría de los preparativos de baja densidad 'de cultivo con o sin el apoyo glía reportado por la literatura existente 2,3,11,13,14. Además de ser ultra-baja densidad, este protocolo es nueva y significativa en dos formas más. En primer lugar, no se necesita …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by an NIH/NIMH grant to S.Q. (R00MH087628).

Materials

Neurobasal medium Life Technologies 21103-049 Protect from light
B27 supplement Life Technologies 17504-044 aliquot, store in 0.6ml size
GlutaMAX-I Life Technologies 35050-061 dilute 100X 
antibiotic-antimycotic (AA) Life Technologies 15240-096 dilute 100X 
Complete Culture medium Neurobasal medium with 1X B27, 1X AA, 1X GlutaMAX-I
Wash medium same as 'Neurobasal medium'
Feed medium Neurobasal with 1X B27 supplement
DNAse I Sigma-Aldrich D5025 prepare 100X stock at 0.6mg/ml
poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407 M.W. 70000-150000
borate buffer Sigma-Aldrich B6768 (boric acid); 71997(borax) 1.24g boric acid & 1.9g borax in 400ml H2O, pH to 8.5 use HCl
12-mm round glass coverslips Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH 1001/12 No. 1 glass, purchase from Carolina Biological Supply
proFection transfection kit Promega E1200 see  protocol for details
2X HEPES buffered saline (HBS) Promega E1200 see  protocol for details
Syringe filter Pall Corporation 4192 0.2um pore size
Endofree plasmid prep kit Qiagen 12362 for preparation of transfection grade plasmid DNA
anti-MAP2 antibody Millipore MAB3418 mouse antibody, clone AP20
anti-p-Tau antibody Millipore AB10417 rabbit polyclonal antibody
anti-NR1 antibody Millipore MAB1586 mouse antibody, clone R1JHL
anti-GluR1 antibody Millipore AB1504 rabbit polyclonal antibody
Hank's balanced salt solution ThermoFisher 14025092 500ml size

References

  1. Banker, G. . Cultureing Nerve Cells. , 339-370 (1998).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  3. Petersen, J. D., Kaech, S., Banker, G. Selective microtubule-based transport of dendritic membrane proteins arises in concert with axon specification. J Neurosci. 34, 4135-4147 (2014).
  4. Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. , (2012).
  5. Shi, Y., Ethell, I. M. Integrins control dendritic spine plasticity in hippocampal neurons through NMDA receptor and Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II-mediated actin reorganization. J Neurosci. 26, 1813-1822 (2006).
  6. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and primary culture of embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. J Vis Exp. , (2011).
  7. Biffi, E., Regalia, G., Menegon, A., Ferrigno, G., Pedrocchi, A. The influence of neuronal density and maturation on network activity of hippocampal cell cultures: a methodological study. PLoS One. 8, e83899 (2013).
  8. Crump, F. T., Dillman, K. S., Craig, A. M. cAMP-dependent protein kinase mediates activity-regulated synaptic targeting of NMDA receptors. J Neurosci. 21, 5079-5088 (2001).
  9. Leal, G., Afonso, P. M., Duarte, C. B. Neuronal activity induces synaptic delivery of hnRNP A2/B1 by a BDNF-dependent mechanism in cultured hippocampal neurons. PLoS One. 9, e108175 (2014).
  10. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nat Rev Neurosci. 14, 311-321 (2013).
  11. Kaneko, A., Sankai, Y. Long-term culture of rat hippocampal neurons at low density in serum-free medium: combination of the sandwich culture technique with the three-dimensional nanofibrous hydrogel PuraMatrix. PLoS One. 9, e102703 (2014).
  12. Millet, L. J., Bora, A., Sweedler, J. V., Gillette, M. U. Direct cellular peptidomics of supraoptic magnocellular and hippocampal neurons in low-density co-cultures. ACS Chem Neurosci. 1, 36-48 (2010).
  13. Salama-Cohen, P., Arevalo, M. A., Meier, J., Grantyn, R., Rodriguez-Tebar, A. NGF controls dendrite development in hippocampal neurons by binding to p75NTR and modulating the cellular targets of Notch. Mol Biol Cell. 16, 339-347 (2005).
  14. Xu, S. Y., Wu, Y. M., Ji, Z., Gao, X. Y., Pan, S. Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. J Biomed Biotechnol. 2012, 803930 (2012).
  15. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  16. Qiu, S., Weeber, E. J. Reelin signaling facilitates maturation of CA1 glutamatergic synapses. J Neurophysiol. 97, 2312-2321 (2007).
  17. Qiu, S., Lu, Z., Levitt, P. MET receptor tyrosine kinase controls dendritic complexity, spine morphogenesis, and glutamatergic synapse maturation in the hippocampus. J Neurosci. 34, 16166-16179 (2014).

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Cite This Article
Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture. J. Vis. Exp. (109), e53797, doi:10.3791/53797 (2016).

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