Summary

Количественная оценка церебральной сосудистой архитектуры с использованием двухфотонного микроскопии в мышиной модели ВИЧ-индуцированной нейровоспаление

Published: January 12, 2016
doi:

Summary

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Abstract

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

Introduction

Вирус иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) вторгается в мозг во время острой фазы вирусной инфекции, и продуктивно инфицирует как микроглии и макрофагов головного мозга, что приводит к их активации – и выпуск обеих принимающих полученных медиаторов воспаления и растворимого ВИЧ-1 virotoxins, такие как Tat и gp120 (обзор в 1,2). Как следствие, хронический нейрогенный государство становится создан в ЦНС, который, как полагают внести свой ​​вклад в патогенезе ВИЧ-1 Associated Нейрокогнитивная расстройств (рука) 3-5.

Хронический сверхэкспрессия ВИЧ-1 Tat или интерлейкина (IL) -17а в ЦНС мышей было показано, приводит к микрососудистой разрежения 6,7. Это повышает вероятность, что хроническое нейровоспаление может внести свой вклад в патогенезе РУКИ через воздействие на церебральной сосудистой. В целях дальнейшего изучения этого вопроса, мы разработали методы для количественного церебральных сосудистых STRUCвания.

В этом документе описан способ количественного определения количества капиллярных узлов, капиллярных сегментов, значит длину сегмента, общую длину сегмента, значит капиллярную диаметре, и общий объем капиллярного использованием в естественных изображений капиллярных сетей через кортикальной окна тонкие черепа (модифицированный от ранее описанных протоколов) 8,9, а также экс естественных изображений срезов головного мозга, используя двухфотонное микроскопии. Этот комбинированный подход обеспечивает целостного количественного мозговых сосудистых параметров, так как в естественных условиях тонкий череп корковых окно позволяет для сохранения головного среды, в то время как экс естественных изображений капиллярных сетей в срезах мозга позволяет реконструкцию полная трехмерная капиллярные сети – которые затем могут быть определены количественно с использованием коммерчески доступного программного обеспечения.

Protocol

Университет Рочестера университета комитета по ресурсам животных одобрил все процедуры, выполняемые в этой статье. 1. Предоперационная подготовка (и мышей) Подготовка хирургического области с всем необходимым оборудованием. Стерилизовать все инструменты, исполь…

Representative Results

Кортикальный окно тонкой черепа позволяет в естественных условиях двухфотонного изображений корковых капилляров (рис 1). Подходящий область, чтобы изображение показывает многочисленные, различные капилляры (рис 1а). В то же поле зрения, нет клет…

Discussion

Способ, описанный здесь, может быть применена для анализа мозга микрососудистых структуры в широком диапазоне экспериментальных моделей / настроек. Для успеха этого метода, три критические шаги должны быть освоены. Во-первых, окно тонкой череп не должен повредить череп или основной мо?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Maria Jepson, Dr. Paivi Jordan, and Dr. Linda Callahan at the University of Rochester Multiphoton Core for technical advice throughout the completion of this protocol. We also thank Dr. Changyong Feng for expert statistical advice, and Dr. Maiken Nedergaard at the University of Rochester Medical Center for the headplate design used in this paper. This work was supported in part by grants T32GM007356 and R01DA026325 from the National Institutes of Health (NIH); and by the University of Rochester Center for AIDS Research grant P30AI078498 (NIH).

Materials

Leica Microscope Leica Inc. MZ8
High Intensity Illuminator Dolan-Jenner 180
Heating Pad Stryker  TP3E
T/PUMP Gaymar Industries, Inc. TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer Datex Ohmeda 447
Artificial Tear Gel Butler AHS 7312
Povidone-Iodine solution  Aplicare 52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors Fine Science Tools 14084-08
Dumot #5 Forceps Fine Science Tools 11295-10
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
Ferric Chloride Solution Ricca Chemical Company 3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel Henkel 45404
Dental Cement Stoelting 51459
Microtoruqe II Handpiece Kit Pearson Dental R14-0002
005 Burr for Micro Drill Fine Science Tools 19007-05
Norland Blade (Dental Microblade) Salvin Dental 6900
Urethane Sigma-Aldrich U2500 Group 2B Carcinogen
Braided Suture Ethicon 735G
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03
 Arterial Catheter SAI Infusion Technologies MAC-01 The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter. 
Blood Pressure Moniter World Precision Intruments SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable World Precision Intruments BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer  Siemens  248
40 μl Capillary Tube VWR 15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline) Invitrogen D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope Olypmus FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser Spectra-Physics
ImageJ Software National Institutes of Health (NIH) Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software Visage Imaging 

References

  1. Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection. Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).
  2. Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. HIV-1 associated dementia: symptoms and causes. Retrovirology. 3, 28 (2006).
  3. Antinori, A., et al. Updated research nosology for HIV-associated neurocognitive disorders. Neurology. 69 (18), 1789-1799 (2007).
  4. Clifford, D. B., Ances, B. M. HIV-associated neurocognitive disorder. The Lancet. Infectious diseases. 13 (11), 976-986 (2013).
  5. Lindl, K. A., Marks, D. R., Kolson, D. L., Jordan-Sciutto, K. L. HIV-associated neurocognitive disorder: pathogenesis and therapeutic opportunities. Journal of neuroimmune pharmacology : the official journal of the Society on NeuroImmune Pharmacology. 5 (3), 294-309 (2010).
  6. Zimmermann, J., et al. CNS-targeted production of IL-17A induces glial activation, microvascular pathology and enhances the neuroinflammatory response to systemic endotoxemia. PloS one. 8 (2), e57307 (2013).
  7. Silva, J. N., et al. Chronic central nervous system expression of HIV-1 Tat leads to accelerated rarefaction of neocortical capillaries and loss of red blood cell velocity heterogeneity. Microcirculation. 21 (7), 664-676 (2014).
  8. Marker, D. F., Tremblay, M. E., Lu, S. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A thin-skull window technique for chronic two-photon in vivo imaging of murine microglia in models of neuroinflammation. Journal of visualized experiments : JoVE. (43), (2010).
  9. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  10. Bruce-Keller, A. J., et al. Morphine causes rapid increases in glial activation and neuronal injury in the striatum of inducible HIV-1 Tat transgenic mice. Glia. 56 (13), 1414-1427 (2008).
  11. Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11014-11019 (2002).
  12. Silva, J., et al. Transient hypercapnia reveals an underlying cerebrovascular pathology in a murine model for HIV-1 associated neuroinflammation: role of NO-cGMP signaling and normalization by inhibition of cyclic nucleotide phosphodiesterase-5. Journal of neuroinflammation. 9, 253 (2012).
  13. Farber, N. E., et al. Region-specific and agent-specific dilation of intracerebral microvessels by volatile anesthetics in rat brain slices. Anesthesiology. 87 (5), 1191-1198 (1997).

Play Video

Cite This Article
Nishimura, C., Polesskaya, O., Dewhurst, S., Silva, J. N. Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (107), e53582, doi:10.3791/53582 (2016).

View Video