Att mäta effekterna av miljögifter på fisk beteende är ofta subjektiv och utmanande särskilt när det handlar om subletala endpoints. Vi beskriver metoder inklusive videoteknik för att kvantifiera simbeteende av de tidiga levnadsstadierna vit stör (Acipenser transmontanus) under och efter 96 tim akut exponering för olika koncentrationer av koppar.
Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.
Att förstå hur förorenings exponering kan påverka beteendet är ibland mycket utmanande och subjektivt. Beteende är normalt definieras som en serie av uppenbara, observer, aktiviteter hela kroppen som verkar genom det centrala nervsystemet och gör det möjligt för en organism att överleva, växa och föröka sig. Beteendeförändringar till följd av exponering för ett giftämne är bland de mest känsliga indikatorer på miljöstress ofta mellan 10-100 gånger känsligare jämfört med överlevnads en. De flesta av dessa studier undersökta simning aktivitet, ventilation och födosöksbeteende fisk 2,3,4. Simning aktivitet är den mest använda subletal slutpunkt för att bestämma en beteendeförändring som svar på en förorening i toxicitetstester 5. Simning variabler är frekvensen och varaktigheten av rörelse, hastighet och tillryggalagd sträcka, frekvens och vinkel varv, ställning i vattnet och mönstret av simning. Simning aktivitet ären effektiv åtgärd av simbeteende vid bedömningen av känslighet för ett toxiskt medel baserat på de kriterier som föreslås i kapitel 9 av Rand 6 i boken Fundamentals of Aquatic Toxicology.
Detta dokument presenterar en toxikologisk studie som ett exempel på hur toxicitet koppar till tidiga liv steg vit stör (Acipenser transmontanus) i olika skeden av tidiga utvecklingen i vatten enbart exponeringar i förhållande till Sturgeon simbeteende utvärderades och illustrerar metoder för att kvantifiera simning beteende.
I tidigare studier, negativa beteendemässiga reaktioner var tydliga med tidig debut under de första dagarna av akuta och kroniska exponeringar mot koppar och blev alltmer allvarlig överexponering varaktighet och koncentration 7,8,9. Magnituden och tidpunkten för uppkomsten av dessa beteendesvar sannolikt tillräckliga för att begränsa den långsiktiga överlevnaden och således är av intresse med tanke på de konsekvenser för recruitment misslyckande 10. För att korrekt tolka betydelsen av denna känslighet för metall och förfaranden exponerings utvecklades för att kvantifiera tidsförloppet och graden av beteende försämringar i förhållande till kopparkoncentrationer.
Testprotokoll för beteende funktion och utveckling fastställdes genom att analysera overhead video prover av stör i exponeringskammare. Videoprovexemplar kvalitativ bedömning av utveckling och funktion hos koppar behandlingar hela exponeringstiden. Beteende och husrum sökande aktivitet utvärderades under exponering för vattenbaserade kopparkoncentrationer för att bestämma tid för att åstadkomma och att karakterisera den temporala sekvensen för nedskrivning som påverkar skydd sökande, letargi, simning samordning, jämvikt, och andning. Dessutom har videoinspelningar gjorda av stör subsamplas från varje replikera i syfte att kvantitativt dokumentera spontan simning aktivitet. Dessa effektmått inkluderade åtgärder längd eller den tid flytta, simning hastighet och tillryggalagd sträcka 5,11 med hjälp av en kommersiellt tillgänglig digital bildanalys programpaket. Denna programvara definierar konturerna av varje bild inom ett synfält och från denna, definierar centroiden för varje bild. Mjukvaran kan sedan spåra positionen för varje tyngd i en bildruta för bildruta följd att bestämma rörelsebanor.
Denna studie uppfyllt alla tillämpliga delar av de slutliga arbetsdjurskyddslagen föreskrifter (9 CFR) och med alla institutionella riktlinjer för human behandling av testorganismerna under kultur och experiment. Vid uppsägning av studien var all fisk avlivas i enlighet med lämpliga riktlinjer som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén för US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.
Förändringar i beteende på grund av exponering för en förorening används ofta som en slutpunkt för subletal toxicitet, men kan vara svåra att mäta. I allmänhet är beteendesvar mätt med visuella observationer och manuell dataanalys som kräver en hel del tid att bearbeta. Men med stigande teknik, har metoder för att kvantifiera simning aktivitet fokuserat på att använda videography 18 och rörelseanalys eller digital mjukvara som minskar den tid bearbetning och analys. Under analys av videon fångade data kvantifiera simning variabler manuellt skulle ha varit mycket tidskrävande så användningen av videodatainspelningar och fisk spårningsprogram som ett mer effektivt och ändamålsenligt sätt för att analysera stör simbeteende. Även förfarandet markerade simning beteendet hos en fisk, anpassa för andra organismer som amfibier och ryggradslösa vattendjur skulle kräva enkla ändringar. Beroende på vad beteende endpoints bemöts, experimentell design och kamerasystem kan utvecklas för användning med nästan alla kommersiellt tillgängliga spårningsprogram paket.
Metoden demonstreras med hjälp av upplöst koppar, men är tillämplig på andra vattenföroreningar eller egenskaper, såsom temperatur eller syrehalt. Protokollen utvecklas och presenteras i detta dokument används en enkel digital videokamera som inspelningsenhet. De digitala filer lätt överföras till en dator och laddat in i rörelse analysprogram. Metoderna ständigt ändras och förfinas för att effektivisera kvantifiering processen. Det är absolut nödvändigt att videokvaliteten vara i HD för att analysen programvara för att identifiera varje enskild fisk för att spåra. Någon bakgrund som inte kontrasterar med fisken kommer att orsaka problem när man försöker bearbeta datafiler. Ett annat vanligt problem med tvådimensionell video tracking är att identifiera individerNär du simmar vägar korsas. Detta kan korrigeras manuellt genom att identifiera varje fisk under vägen korsningen och koppla upp vägsegmenten i programvaran. Alternativt kan total aktivitet bestämmas från varje replikat kammare som en grupp i genomsnitt. Flera enskilda kammare med var och en innehållande en fisk kan filmas i samma synfält för att beräkna rörelser enskilda fiskar.
För närvarande har vi uppgraderat till att använda en serie av overhead övervakningskameror ovanför exponeringskammare som är kopplade till en högupplöst digital videoinspelning enhet (HD-DVR). Emellertid kommer användningen av någon kamera system som kan spela in högupplösta MPEG-4 video fungerar. HD-DVR kan ställas in för att spela in vid en viss tidpunkt och programmeras för upp till 7 dagar. Detta hands-off automatiserade tillvägagångssätt gör det möjligt att fånga flera filmer samtidigt att upprätthålla konsekvens och samtidigt minimera yttre störningar som skulle kunna äventyra fiskens beteende. HD-DVR systems är anslutna till ett internt nätverk så att överföra filer är relativt enkel. Medan den automatiska kamerasystemet är en mycket förbättrad teknik för att kvantifiera simbeteende, är det fortfarande fördelaktigt att genomföra visuella observationer att fungera som ytterligare underlag för att dokumentera beteende försämring under toxicitetstester.
Det finns en lång historia av litteratur dokumentera förändrad fiskens beteende till följd av exponering för metaller som går tillbaka till det tidiga 1960-talet 19,20,21. Koppar har visat sig orsaka förändringar i aktivitetsnivåer som hypoaktivitet i bluegill 22 (Lepomis macrochirus Rafinesque) och förändringar i rörelse och näring av bäckröding 23 (Salvelinus fontinalis). Åtminstone några ung fisk förlitar sig på sitt luktsinne för att upptäcka och undvika rovdjur, och koppar-inducerad Chemosensory brist kan påverka beteenden i samband med detektering av larm kemikalier 24,25,26 </sup>. Luktepitel är skadad på grund av kopparexponering vilket påverkar sensoriska mekanismer som kan leda till förvirring, beteende undvikande, minskad utfodring och andra beteenden som styrs av lukt 27. Dessa förändrade beteenden överensstämde med vad som observerades under exponeringarna.
Simbas beteende vit stör var kraftigt påverkades under subletal exponering för vattenhaltiga kopparkoncentrationer .. Dessa resultat illustrerar hur beteendet påverkas vid subletala koncentrationer av koppar och kan användas som en indikator på toxisk stress. Videon baserad analys visat sig vara effektiva i att kvantifiera simning beteende och även varit kvalitativ visuell dokumentation av de allvarliga effekter på stör utsätts för koppar. Analysen Programvaran är också möjligt att kvantifiera andra beteende ändpunkter. Se tabell 1 för en lista. Exponeringssystemet kan modifieras för att ta itu med varje ändpunkt irealtid läge och kan användas för att kvantifiera skillnader i beteende i samband med exponering för olika föroreningar av oro.
Användningen av beteende endpoints i vattenmiljön toxikologisk forskning är allt anställd och bör övervägas vid utvärdering av effekterna av föroreningar eftersom adaptiv beteende funktion är avgörande vid fastställandet av miljöskador 9. Effekterna av miljöföroreningar till fiskens beteende är ofta subjektiv och utmanande särskilt när det handlar om subletala endpoints i frånvaro av standardmetoder ..
Simning aktivitet som kvantifieras med hjälp av dessa metoder kan noggrant övervakas, är icke-förstörande med minimal belastning på organismen och kan upprepas. Simning beteende är en giltig och konsekvent index för subletal toxicitet som bör ingå i testprotokoll för att utöka känsligheten av test 5 standardtoxicitets.
The authors have nothing to disclose.
We thank the staff in the Ecology Branch, Toxicology Branch and Environmental Chemistry Branch of the U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center for technical and analytical assistance. Funding provided in part by Teck American Incorporated through an agreement with the US Environmental Protection Agency (USEPA) Region 10 with funds provided by USEPA to US Geological Survey (USGS) through the Department of Interior Central Hazmat Fund.
copper II sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | contaminant of concern | |
syringe dispenser | Hamilton MicroLab 600 Series | apparatus to spike chemical | |
2-L volumetric flask | container for holding stock solution | ||
24-1.5 L glass jars | test chamber for 2 dph sturgeon | ||
video camera | Sony Handycam HDR-CX550V | ||
digital tracking software | Noldus Ethovision | ||
3-17" flat screen monitors | |||
24 surveillance cameras | Model CL101 | ||
3-16 channel digital recording devices | |||
DO meter | YSI | ||
pH meter | Orion 940 | ||
ph probe | Orion | ||
ammonia meter | |||
ammonia probe | Orion | ||
chiller unit | |||
recirculating water pump |