컴퓨터 원호 비디오 및 디지털 이미지 분석을 사용하여 수성 구리의 급성 노출에 대한 응답에 물고기가 수영 동작을 정량화
Summary
물고기의 행동에 환경 오염 물질의 영향을 측정하는 것은 종종 주관적이고 치사 엔드 포인트를 다룰 때 특히 도전이다. 우리는 동안 구리 다양한 농도의 96 시간 급성 노출 후 초기 생활 단계 흰 철갑 상어 (인 Acipenser transmontanus)의 수영 동작을 정량화하는 비디오 기술을 포함하는 방법을 설명합니다.
Abstract
Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.
Introduction
오염 물질 노출이 행동에 영향을 미칠 수있는 방법을 이해하는 것은 시간에 매우 도전적이고 주관적이다. 동작은 전형적으로는 중추 신경계를 통해 작동하고, 생존, 성장 및 재생하도록 유기체있게 명백한, 관찰, 전신 활동의 시리즈로서 정의된다. 생존 1에 비해 인한 독성 물질에 노출 행동의 변화는 환경 스트레스 종종 10 ~ 100 사이 배 더 민감의 가장 민감한 지표 중입니다. 이러한 연구의 대부분은 활동, 환기 수영, 물고기 2,3,4의 행동을 구하고 조사했다. 활동을 수영 독성 시험 (5)에 오염 물질에 대한 응답으로 행동 변화를 결정하는 가장 자주 사용 치사 엔드 포인트입니다. 수영 변수는 주파수와 여행 운동 속도와 거리의 지속 시간, 빈도와 회전 각도, 위치 물 열에서 수영의 패턴을 포함한다. 실내 활동은수영 동작의 효과 측정 수생 독성의 책을 기본으로 랜드 (6)에 의해 제 9 장에서 제안 된 기준에 따라 독성 물질에 대한 민감도를 평가.
이 논문은 초기 개발의 여러 단계에서 초기 생활 단계 흰 철갑 상어 구리의 독성 (인 Acipenser transmontanus) 물 전용 수영 동작을 평가 하였다 철갑 상어에 대해 익스포저 방법의 예로서 독성 학적 연구를 제시하고 수영을 정량화하는 방법을 보여줍니다 행동.
이전의 연구에서, 이상 행동 반응은 구리에 대한 급성 및 만성 노출의 처음 몇 일 동안 조기 발병에 분명했다 및 노출 시간과 농도 7, 8, 9를 통해 점진적으로 더 심각했다. 이러한 크기 및 행동 반응의 개시의 타이밍은 장기 생존율을 제한하기에 충분한 가능성이있어 recrui 대한 영향 주어진 관심있는tment 실패 10. 정확하게 금속 노광 방법 및 절차에이 감도의 의미를 해석하기 위해, 구리의 농도에 대하여 행동 장애의 시간 경과와 정도를 정량화하기 위해 개발되었다.
행동 기능과 개발을위한 시험 프로토콜이 노출 챔버에서 철갑 상어의 오버 헤드 비디오 샘플을 분석하여 설립되었다. 비디오 샘플의 노출 기간에 걸쳐 구리 처리 구간 발전 기능 질적 평가를 제공 하였다. 행동과 쉼터 추구 활동에 영향을하고 조정, 균형, 호흡 수영, 쉼터 추구, 무기력에 영향을 미치는 손상의 시간적 순서를 특성화하는 시간을 결정하는 수성 구리 농도에 노출시 평가 하였다. 또한, 비디오 녹화 정량적 문서화 자발 수영 ACTI의 목적으로 복제 각각으로부터 서브 샘플링 철갑 만들어졌다vity. 이 엔드 포인트는 시간 측정치를 포함하거나 시간은 속도 및 거리가 시판 디지털 영상 분석 소프트웨어 패키지를 사용 5,11 여행 수영 이동 보냈다. 이 소프트웨어는 시야 내의 각 화상의 윤곽선을 정의하고, 이로부터 각 화상의 중심을 정의한다. 소프트웨어는 이동 경로를 결정하기 위해 프레임 연속하여 프레임의 각 중심의 위치를 추적 할 수있다.
동물 복지법 규정 (9 CFR)의 최종 규칙의 모든 해당 섹션으로 문화와 실험 기간 동안 시험 생물의 인도적인 처리를위한 모든 제도적 가이드 라인을 준수이 연구. 연구 종료되면, 모든 물고기는 미국 지질 조사를위한 기관 동물 관리 및 사용위원회, 컬럼비아 환경 연구 센터에 의해 승인 된 적절한 가이드 라인에 따라 안락사시켰다.
Protocol
Representative Results
Discussion
때문에 오염 물질에 노출 행동의 변화는 종종 서브 치명적인 독성에 대한 엔드 포인트로 사용되지만 측정하기 어려울 수 있습니다. 일반적으로, 동작 응답을 처리하기 위해 많은 시간을 필요로 육안 관찰과 수동 데이터 분석에 의해 측정된다. 그러나 기술 발전으로 정량화 수영 활동 방법은 처리 및 분석 시간을 단축 촬용 18 움직임 분석 또는 디지털 추적 소프트웨어를 사용하는 방법에 초점을 맞추고있다. 영상 분석 동안 너무 철갑 수영 동작을 분석 더욱 효과적이고 효율적인 방법을 제공하는 비디오 데이터 기록 및 물고기 추적 소프트웨어의 사용을 소모 수동 매우 시간했을 수영 변수 정량화 데이터를 캡처. 절차는 간단 수정을 요구 양서류 및 수생 무척추 동물 등의 생물에 대한 정의, 물고기의 행동을 수영 강조하지만. 어떤 행동 endpoin에 따라TS는 실험 설계 및 카메라 시스템은 거의 모든 시판 추적 소프트웨어 패키지와 함께 사용하기 위해 개발 될 수있다, 해결되고있다.
이 방법은 용해 된 구리를 이용하여 증명하지만, 다른 수성 오염이나 온도, 산소 농도 등의 특성에 적용 할 수있다. 이 논문에서 개발되게 프로토콜 기록 장치로서 간단한 디지털 비디오 카메라를 이용했다. 디지털 파일 쉽게 컴퓨터로 전송 및 움직임 분석 소프트웨어에 업로드된다. 방법은 지속적으로 수정 및 정량화 프로세스를 간소화하기 위해 정제되고있다. 비디오 품질 추적 각 물고기를 식별 분석 소프트웨어 위해서는 고해상도 인 것이 필수적이다. 데이터 파일을 처리하는 경우 물고기 대조하지 않는 백그라운드 문제를 일으킬 것이다. 두 차원 영상 추적의 또 다른 일반적인 문제는 식별 개인이다수영 경로가 교차 할 때. 이 경로를 횡단하는 동안 각각의 물고기 식별 소프트웨어 내 경로 세그먼트를 연결하여 수동으로 보정 할 수있다. 대안 적으로, 전체 활성은 그룹 평균 각 복제에 챔버로부터 결정될 수있다. 한 물고기를 포함하는 각 하나에 여러 개별 실 개별 물고기의 움직임을 계산하는보기의 동일한 필드에서 촬영 할 수 있습니다.
현재 우리가 고화질 디지털 비디오 기록 장치 (HD-DVR)에 연결되어 노출 된 상기 챔버 헤드 감시 카메라의 시리즈를 사용하여 업그레이드. 그러나, 고화질 MPEG-4 비디오를 촬영할 수있는 카메라 시스템의 사용 일 것이다. HD-DVR은 지정된 시간에 레코드로 설정하고 최대 7 일 동안 프로그래밍 될 수있다. 접근 방식을 자동화이 손을 놓은 물고기의 행동을 손상시킬 수있는 외부 교란을 최소화하면서 일관성을 유지하는 동시에 여러 동영상의 캡처를 할 수 있습니다. HD-DVR의 정기적 복용단말이 내부 네트워크에 연결하기 때문에 파일의 전송은 비교적 간단하다. 자동 카메라 시스템 수영 동작을 정량화 더욱 향상된 기술이지만, 여전히 독성 시험 동안 행동 장애 문서화와 같은 추가적인 지원 정보를 제공하는 시각적 관찰을 수행하는 것이 유익하다.
1960 년대 초 19,20,21로 거슬러 올라가는 금속에 노출로 인한 문학 문서화 변경 물고기의 행동의 오랜 역사이있다. 구리는 이러한 송어 22 hypoactivity 등의 활동 수준의 변화를 야기하는 것으로 나타났다 (인 Lepomis macrochirus rafinesque)과 전위의 변화와 민물 송어 (23)의 먹이 활동 (Salvelinus fontinalis). 적어도 일부 청소년 물고기 감지하고 포식자를 피하고, 구리 유도 화학 감각 부족이 검출 경보 화학 물질 24,25,26를 관련 행동에 영향을 미칠 수있는 위해 냄새의 감각에 의존 </sup>. 후각 상피 인해함으로써, 방향 감각 상실, 행동 적 회피, 감소 공급 및 후각 (27)에 의해 유도되는 다른 행동을 초래할 수 감각 메커니즘에 영향을 미치는 구리 노출로 손상되었습니다. 이러한 변경 행동은 노출 동안 관찰 된 것과 일치했다.
흰 철갑 상어의 수영 동작은 크게 이러한 결과는 행동이 구리의 치사 농도에 영향을 독성 스트레스의 지표로 사용하는 방법을 설명 .. 수성 구리 농도 치사 노출시 영향을 하였다. 비디오 기반의 분석은 수영 동작을 정량화 효과가 입증 또한 구리에 노출 철갑 상어에 심각한 영향의 질적 시각적 문서 역임했다. 분석 소프트웨어는 각종 행동 끝점을 정량화 할 수있다. 목록은 표 1을 참조하십시오. 노광 시스템은 각각의 포인트를 해결하기 위해 변형 될 수있다실시간 모드가 우려 각종 오염물에 대한 노출과 연관된 동작의 차이를 정량화 할 수있다.
수생 독성 연구 행동 엔드 포인트의 이용은 점점 더 채용 적응 행동 함수 환경 손상 (9)의 판정에 결정적이기 때문에 오염의 효과를 평가할 때 고려되어야한다. 물고기의 행동에 환경 오염 물질의 영향은 종종 주관적 및 표준 방법의 부재 치사 엔드 포인트를 다룰 때 특히 도전이다 ..
엄밀하게 모니터링 할 수있는 이러한 방법을 사용하여 정량화 활성 수영 유기체 최소 응력 비파괴 및 반복 될 수있다. 동작 수영 표준 독성 시험 (5)의 감도를 확장 테스트 프로토콜에 포함되어야 치사 독성 유효 일관된 인덱스이다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the staff in the Ecology Branch, Toxicology Branch and Environmental Chemistry Branch of the U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center for technical and analytical assistance. Funding provided in part by Teck American Incorporated through an agreement with the US Environmental Protection Agency (USEPA) Region 10 with funds provided by USEPA to US Geological Survey (USGS) through the Department of Interior Central Hazmat Fund.
Materials
| copper II sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | contaminant of concern | |
| syringe dispenser | Hamilton MicroLab 600 Series | apparatus to spike chemical | |
| 2-L volumetric flask | container for holding stock solution | ||
| 24-1.5 L glass jars | test chamber for 2 dph sturgeon | ||
| video camera | Sony Handycam HDR-CX550V | ||
| digital tracking software | Noldus Ethovision | ||
| 3-17" flat screen monitors | |||
| 24 surveillance cameras | Model CL101 | ||
| 3-16 channel digital recording devices | |||
| DO meter | YSI | ||
| pH meter | Orion 940 | ||
| ph probe | Orion | ||
| ammonia meter | |||
| ammonia probe | Orion | ||
| chiller unit | |||
| recirculating water pump |
References
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