Kvantificering Fish Swimming adfærd som reaktion på akut Eksponering af Vandig Kobber Brug Computer Assisted Video og Digital Image Analysis
Summary
Måling af virkningerne af miljøbelastende stoffer på fisk adfærd er ofte subjektive og udfordrende især når det drejer sig subletale endepunkter. Vi beskriver metoder, herunder video-teknologi til at kvantificere svømning adfærd tidlige livsfase hvid stør (Acipenser transmontanus) under og efter 96 timers akutte eksponering for forskellige koncentrationer af kobber.
Abstract
Behavioral responses of aquatic organisms to environmental contaminants can be precursors of other effects such as survival, growth, or reproduction. However, these responses may be subtle, and measurement can be challenging. Using juvenile white sturgeon (Acipenser transmontanus) with copper exposures, this paper illustrates techniques used for quantifying behavioral responses using computer assisted video and digital image analysis. In previous studies severe impairments in swimming behavior were observed among early life stage white sturgeon during acute and chronic exposures to copper. Sturgeon behavior was rapidly impaired and to the extent that survival in the field would be jeopardized, as fish would be swept downstream, or readily captured by predators. The objectives of this investigation were to illustrate protocols to quantify swimming activity during a series of acute copper exposures to determine time to effect during early lifestage development, and to understand the significance of these responses relative to survival of these vulnerable early lifestage fish. With mortality being on a time continuum, determining when copper first affects swimming ability helps us to understand the implications for population level effects. The techniques used are readily adaptable to experimental designs with other organisms and stressors.
Introduction
Forståelse af hvordan forurenende eksponering kan påvirke adfærd er til tider meget udfordrende og subjektiv. Opførsel defineres typisk som en række åbenlyse, observerbare, hele kroppen aktiviteter, der opererer gennem centralnervesystemet og muliggør en organisme til at overleve, vokse og formere sig. Ændringer i adfærd som følge af eksponering for et giftstof er blandt de mest følsomme indikatorer for miljøbelastning ofte mellem 10-100 gange mere følsom i forhold til overlevelsen 1. De fleste af disse undersøgelser undersøgte svømning aktivitet, ventilation og fourageringsadfærd af fisk 2,3,4. Svømning aktivitet er den hyppigst anvendte subletal endpoint i bestemmelse af en adfærdsændring som svar på et forurenende stof i toksicitetstest 5. Svømning variable omfatter hyppighed og varighed af bevægelse, hastighed og distance, hyppigheden og vinkel sving, position i vandsøjlen og mønstret for svømning. Svømning aktivitet eren effektiv foranstaltning af svømmeadfærd ved vurderingen af følsomhed over for en giftstof baseret på de foreslåede i kapitel 9 af Rand 6 i bogen Fundamentals of Aquatic Toxicology kriterier.
Denne artikel præsenterer en toksikologisk undersøgelse som et eksempel på, hvordan giftigheden af kobber til tidlige liv-stadie hvid stør (Acipenser transmontanus) på forskellige stadier af tidlig udvikling i vand alene eksponeringer i forhold til Sturgeon svømmeadfærd blev evalueret, og illustrerer metoder til kvantificering svømning opførsel.
I tidligere undersøgelser, uønskede adfærdsmæssige reaktioner var tydelige med tidlig debut i de første par dage af akutte og kroniske eksponeringer for kobber og blev gradvist mere alvorlig i varighed eksponering og koncentration 7,8,9. Størrelsen og timingen af udbrud af disse adfærdsmæssige reaktioner er sandsynligvis nok til at begrænse langsigtede overlevelse og dermed er til bekymring, da konsekvenserne for recruitment fiasko 10. For nøjagtigt at fortolke betydningen af denne følsomhed over for metal metoder og procedurer eksponering blev udviklet til kvantificering af tidsforløbet og omfanget af adfærdsmæssige svækkelser i forhold til kobber koncentrationer.
Test protokoller for adfærdsmæssige funktion og udvikling blev oprettet ved at analysere overliggende video prøver af stør i afdelinger eksponering. Videoen prøveemner kvalitativ vurdering af udvikling og funktion blandt kobber behandlinger i hele perioden eksponering. Adfærd og læ-søger aktivitet blev evalueret i løbet af eksponeringer for vandige koncentrationer kobber til at bestemme tid til at gennemføre og at beskrive den tidsmæssige rækkefølge af værdiforringelse, der påvirker husly søger, sløvhed, svømning koordination, balance og åndedræt. Desuden blev videooptagelser lavet af stør subsampled fra hver gentagelse med henblik på kvantitativt at dokumentere spontan svømning aktivity. Disse endepunkter omfattede foranstaltninger varighed og den tid flytter, svømning hastighed og distance 5,11 ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt digitalt billede analyse software pakke. Denne software definerer omridset af hvert billede i et synsfelt og fra dette, definerer geometriske tyngdepunkt for hvert billede. Softwaren derefter kan spore positionen af hver tyngdepunkt i en ramme for ramme hinanden for at bestemme bevægelsesbaner.
Denne undersøgelse overholdt alle relevante afsnit af den endelige forretningsorden dyreværnsloven forskrifter (9 CFR) og med alle institutionelle retningslinjer for human behandling af testorganismerne under kultur og eksperimenter. Ved opsigelse af undersøgelsen blev alle fisk aflivet efter passende retningslinjer, som er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for US Geological Survey, Columbia Environmental Research Center.
Protocol
Representative Results
Discussion
Adfærdsændringer følge af eksponering for en forurening anvendes ofte som et slutpunkt for sub-letal toksicitet, men kan være svær at måle. Generelt er adfærdsmæssige reaktioner målt ved visuelle observationer og manuel dataanalyse, som kræver en masse tid til at behandle. Men med avanceret teknologi, har metoder til kvantificering svømning aktivitet fokuseret på at bruge videography 18 og bevægelsesanalyse eller digital tracking software, der reducerer behandling og analyse tid. Under analysen af video optaget data, kvantificering svømning variabler manuelt ville have været meget tidskrævende, så brugen af video-data optagelser og fisk tracking software forudsat en mere effektiv og effektiv måde til at analysere stør svømning adfærd. Selv om proceduren fremhævet svømning opførsel af en fisk, tilpasning til andre organismer såsom padder og hvirvelløse vanddyr ville kræve simple ændringer. Afhængigt af hvad adfærdsmæssige Slutpunts bliver behandlet, kan udvikles eksperimentelle design og kamerasystemer til brug med næsten enhver kommercielt tilgængelig tracking software-pakke.
Fremgangsmåden demonstreres ved hjælp opløst kobber, men kan anvendes til andre vandige kontaminanter eller karakteristika, såsom temperatur eller iltindhold. Protokollerne udviklet og præsenteret i dette papir udnyttet et simpelt digitalt videokamera som optageenhed. De digitale filer er let overføres til en computer og uploades i den bevægelse analyse software. Metoderne bliver hele tiden ændres og raffineret at strømline kvantificering processen. Det er bydende nødvendigt, at videokvaliteten være i high definition, for at analyse software til at identificere hver enkelt fisk til sporing. Enhver baggrund, der ikke kontrast med de fisk vil give problemer, når de forsøger at behandle datafiler. Et andet fælles problem med todimensional video tracking er identificere enkeltpersonernår svømning stier krydser. Dette kan korrigeres manuelt ved at identificere hver fisk under stien passage og forbinde op kurvesegmenter i softwaren. Alternativt kan den samlede aktivitet bestemmes ud fra hvert replikat kammer som en gruppe gennemsnit. Flere individuelle kamre med hver indeholder én fisk kan blive filmet i det samme synsfelt til at beregne bevægelser fisk.
I øjeblikket har vi opgraderet til at bruge en række overliggende overvågningskameraer over kamrene eksponering, der er knyttet til en high definition digital videooptagelse enhed (HD-DVR). anvendelse af en kamerasystem, som kan optage high definition MPEG-4 video, vil imidlertid virke. Den HD-DVR kan indstilles til optage på et bestemt tidspunkt og programmeret i op til 7 dage. Dette hands-off automatiseret metode gør det muligt at indfange flere videoer på samme tid at bevare sammenhængen samtidig minimere eksterne forstyrrelser, der kunne kompromittere fiskenes adfærd. Den HD-DVR systems er forbundet til et internt netværk så overføre filer er forholdsvis enkel. Mens det automatiske kamera system er en langt bedre teknik til at kvantificere svømmeadfærd, er det stadig en fordel at foretage visuelle observationer til at tjene som yderligere supplerende oplysninger til dokumentation af adfærdsmæssige forringelse under toksicitetstest.
Der er en lang tradition for litteratur dokumenterer ændret fiskenes adfærd som følge af udsættelse for metaller går tilbage til begyndelsen af 1960'erne 19,20,21. Kobber har vist sig at forårsage ændringer i aktivitetsniveauet som hypoaktivitet i bluegill 22 (Lepomis macrochirus rafinesque) og ændringer i bevægeapparatet og fodring aktivitet af kildeørred 23 (Salvelinus fontinalis). I det mindste nogle ungfisk stole på deres lugtesans til at opdage og undgå rovdyr, og kobber-induceret chemosensory afsavn kan påvirke adfærd i relation til afsløre alarm kemikalier 24,25,26 </sup>. Den olfaktoriske epitel er beskadiget på grund af kobber eksponering dermed påvirke sensoriske mekanismer, der kan resultere i desorientering, adfærdsmæssige undgåelse, reduceret fodring og andre adfærd, der er styret af lugtesansen 27. Disse ændrede adfærd var i overensstemmelse med, hvad der blev observeret under eksponeringerne.
Den svømmeadfærd af hvide stør blev stærkt påvirket under subletale udsættelse for vandige kobberkoncentrationer .. Disse resultater viser, hvordan adfærd påvirkes ved subletale koncentrationer af kobber og kan bruges som indikator for toksisk stress. Videoen baseret analyse vist sig effektiv i at kvantificere svømning adfærd og også tjent som kvalitativt visuel dokumentation af de alvorlige konsekvenser for stør udsat for kobber. Analysen software er også i stand til at kvantificere andre forskellige adfærdsmæssige endepunkter. Der henvises til tabel 1 for en liste. Eksponeringen systemet kan ændres for at løse hvert endepunkt irealtidstilstand og kan bruges til at kvantificere forskelle i adfærd forbundet med udsættelse for forskellige forurenende stoffer giver anledning til bekymring.
Brugen af adfærdsmæssige endepunkter i akvatisk toksikologisk forskning er i stigende grad ansat, og bør overvejes ved evaluering af virkningerne af forurenende stoffer, fordi adaptive adfærdsmæssige funktion er afgørende i bestemmelsen af miljømæssig skade 9. Virkningerne af miljøbelastende stoffer til fisk adfærd er ofte subjektive og udfordrende især når der beskæftiger sig med subletale endepunkter i mangel af standardmetoder ..
Svømning aktivitet som kvantificeret ved hjælp af disse metoder kan overvåges nøje, er ikke-destruktiv med minimal belastning af organismen og kan gentages. Svømning adfærd er en gyldig og sammenhængende indeks for subletale toksicitet, som bør indarbejdes i testprotokoller at udvide følsomheden af standard toksicitetstest 5.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the staff in the Ecology Branch, Toxicology Branch and Environmental Chemistry Branch of the U.S. Geological Survey, Columbia Environmental Research Center for technical and analytical assistance. Funding provided in part by Teck American Incorporated through an agreement with the US Environmental Protection Agency (USEPA) Region 10 with funds provided by USEPA to US Geological Survey (USGS) through the Department of Interior Central Hazmat Fund.
Materials
| copper II sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | contaminant of concern | |
| syringe dispenser | Hamilton MicroLab 600 Series | apparatus to spike chemical | |
| 2-L volumetric flask | container for holding stock solution | ||
| 24-1.5 L glass jars | test chamber for 2 dph sturgeon | ||
| video camera | Sony Handycam HDR-CX550V | ||
| digital tracking software | Noldus Ethovision | ||
| 3-17" flat screen monitors | |||
| 24 surveillance cameras | Model CL101 | ||
| 3-16 channel digital recording devices | |||
| DO meter | YSI | ||
| pH meter | Orion 940 | ||
| ph probe | Orion | ||
| ammonia meter | |||
| ammonia probe | Orion | ||
| chiller unit | |||
| recirculating water pump |
References
- Gerhardt, A. Aquatic behavioral ecotoxicology-prospects and limitations. Hum Ecol Risk Assess: An International Journal. 13 (3), 481-491 (2007).
- Beitinger, T. L. Behavioral reactions for the assessment of stress in fishes. J Great Lakes Res. 16, 495-528 (1990).
- Beitinger, T. L., McCauley, R. W. Whole-animal and physiological processes for the assessment of stress in fishes. J Great Lakes Res. 16, 542-575 (1990).
- Dell’Omo, G. . Behavioural Ecotoxicology. , (2002).
- Little, E. E., Finger, S. E. Swimming behavior as an indicator of sublethal toxicity in fish. Environ Toxicol Chem. 9, 13-19 (1990).
- Rand, G. M., Rand, G. M., Petrocelli, S. R. Behavior. Fundamentals of Aquatic Toxicology: Methods and Applications. , 221-256 (1985).
- Calfee, R. D., et al. Acute sensitivity of white sturgeon (Acipenser transmontanus) and rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) to copper, cadmium, or zinc in water-only laboratory exposures. Environ Toxicol Chem. 33 (10), 2259-2272 (2014).
- Little, E. E., Calfee, R. D., Linder, G. Toxicity of smelter slag-contaminated sediments from Upper Lake Roosevelt and associated metals to early life stage White Sturgeon (Acipenser transmontanus Richardson, 1836). J Appl Ichthyol. , 1-11 (2014).
- Wang, N., et al. Chronic sensitivity of white sturgeon (Acipenser transmontanus) and rainbow trout (Onchorhynchus mykiss) to cadmium, copper, lead or zinc in water-only laboratory exposures. Environ Toxicol Chem. 33 (10), 2246-2258 (2014).
- Little, E. E., Dell’Omo, G. Behavioral measures of injuries to fish and aquatic organisms: regulatory considerations. Behavioural Ecotoxicology. , 411-431 (2002).
- Little, E. E., Brewer, S. K., Schlenk, D., Benson, W. H. Neurobehavioral toxicity in fish. Target Organ Toxicity in Marine and Freshwater Teleosts New Perspectives: Toxicology and the Environment. Volume 2. , 139-174 (2001).
- Mount, D. I., Brungs, W. A. A simplified dosing apparatus for fish toxicological studies. Water Res. 1, 21-29 (1967).
- . Standard guide for performing early life-stage toxicity tests with fishes. Annual.Book of ASTM International Standards. Volume 11.06. , 1241-1305 (2013).
- . Standard guide for measurement of behavior during fish toxicity tests. Annual.Book of ASTM Standards. Volume 11.06. , 1711 (2014).
- . Standard guide for conducting acute toxicity tests on test materials with fishes, macroinvertebrates, and amphibians. Annual.Book of ASTM Standards. Volume 11.06. , 729-796 (2014).
- Brunson, , et al. Assessing bioaccumulation of contaminants from sediments from the upper Mississippi River using field-collected oligochaetes and laboratory-exposed Lumbriculus variegatus. Arch Environ ConTox. 5, 191-201 (1998).
- Brumbaugh, W. G., May, T. W., Besser, J. M., Allert, A. L., Schmitt, C. J. Assessment of elemental concentrations in streams of the New Lead Belt in southeastern Missouri, 2002-05. U.S. Geological Survey Scientific Investigations Report 2007-5057. , (2007).
- Kane, A. S., Salierno, J. D., Gipson, G. T., Molteno, T. C. A., Hunter, C. A video-based movement analysis system to quantify behavioral stress responses of fish. Water Res. 38, 3993-4001 (2004).
- Sprague, J. B. Avoidance of Copper-Zinc Solutions by Young Salmon in the Laboratory. JWater Pollut Control Fed. 36 (8), 990-1004 (1964).
- Saunders, R. L., Sprague, J. B. Effects of copper-zinc mining pollution on a spawning migration of Atlantic salmon. Water Res. 1 (6), 419-432 (1967).
- Barron, M. G., Dell’Omo, G. Environmental contaminants altering behavior. Behavioural Ecotoxicology. , 167-186 (2002).
- Ellgaard, E. G., Guillot, J. L. Kinetic analysis of the swimming behavior of bluegill sunfish, Lepomis macrochirus rafinesque, exposed to copper: hypoactivity induced by sublethal concentrations. J Fish Biol. 33, 601-608 (1998).
- Drummond, R. A., Spoor, W. A., Olson, G. G. Some short-term indicators of sublethal effects of copper on brook trout, Salvelinus fontinalis. J Fish Res Board Can. 30, 698-701 (1973).
- Hansen, J. A., Rose, J. D., Jenkins, R. A., Gerow, K. G., Bergman, H. L. Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) exposed to copper: neurophysiological and histological effects on the olfactory system. Environl Toxicol Chem. 18, 1979-1991 (1999).
- Sandahl, J. F., Baldwin, D. H., Jenkins, J. J., Scholz, N. L. A sensory system at the interface between urban stormwater runoff and salmon survival. Environ Sci Technol. 41 (8), 2998-3004 (2007).
- McIntyre, J. K., Baldwin, D. H., Beauchamp, D. A., Scholz, N. L. Low-level copper exposures increase visibility and vulnerability of juvenile coho salmon to cutthroat trout predators. Ecol Appl. 22 (5), 1460-1471 (2012).
- Green, W. W., Mirza, R. S., Wood, C. M., Pyle, G. G. Copper binding dynamics and olfactory impairment in fathead minnows (Pimephales promelas). Environ Sci Technol. 44 (4), 1431-1437 (2010).
