Summary

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Published: April 02, 2016
doi:

Summary

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

Abstract

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Introduction

En imágenes in vivo proporciona una visualización directa de los comportamientos celulares en el contexto más fisiológica. La transparencia de los embriones de pez cebra, su rápido desarrollo y externa y una rica variedad de herramientas genéticas que permiten el marcaje fluorescente, han contribuido a la creciente utilización de la microscopía in vivo para dilucidar la dinámica de eventos de desarrollo claves. Los estudios de imágenes del desarrollo del sistema nervioso en el pez cebra tienen, por ejemplo, se expandió enormemente nuestro conocimiento del comportamiento de las células progenitoras neurales y el destino de su progenie, incluyendo su posterior migración, la diferenciación y la integración del circuito 1-8.

El escenario está listo para investigar la dinámica subcelulares que subyacen a estos comportamientos celulares. De hecho, el pez cebra ya están siendo explotados como herramientas para la biología de las células en vivo. Ahora es posible visualizar las mitocondrias 9-11, centrosomas 2,8,12-14, 15 de Golgi, Los microtúbulos y la actina 4 16 citoesqueleto, endosomes 17 y los componentes de la membrana apical complejo 1,18, entre otras estructuras subcelulares en embriones de pez cebra en vivo. Hasta ahora, gran parte de lo que se conoce acerca de la función de estos orgánulos proviene de estudiar su comportamiento en células cultivadas. Mientras que los estudios in vitro han dado mucha información sobre los biología celular, las células en cultivo no representan plenamente la complejidad de la situación in vivo y por lo tanto no reflejan necesariamente la función y dinámica de los orgánulos subcelulares in vivo. Embriones de pez cebra ofrecen una alternativa viable en vivo para examinar la dinámica subcelulares.

Como los vertebrados, el pez cebra posee muchos sistemas de órganos (por ejemplo, la retina neural) que son homólogas a las que se encuentran en especies de mamíferos. Además, embriones de pez cebra son cada vez más utilizados para modelar enfermedades humanas 19,20 </sarriba>, incluidos los relacionados con la función centrosómicas (por ejemplo, microcefalia 21 y amaurosis 22 congénita de Leber) y para la función mitocondrial (por ejemplo, enfermedad de Parkinson 23, tauopatías 10,24 y el síndrome de Barth 25). imágenes in vivo a nivel celular y subcelular en estos casos permitirá una mejor comprensión de la biología de las células que subyace a estos estados patológicos.

El objetivo general de los métodos descritos aquí es proporcionar una guía completa para investigar orgánulos y otras estructuras subcelulares en embriones de pez cebra utilizando microscopía de luz en vivo. Todo el flujo de trabajo involucrado en la visualización y el seguimiento de las estructuras subcelulares en vivo se describe – a partir de enfoques genéticos de etiquetado, para generar transitoriamente expresar y peces transgénicos estable, y finalmente a la formación de imágenes usando de campo amplio y microscopía confocal. Aunque cada uno de estos procedures es utilizada por numerosos laboratorios de pez cebra, los protocolos descritos se han optimizado y simplificado para la investigación de la dinámica de las estructuras subcelulares. Dos aspectos específicos del trabajo aquí descrito garantizan mención: En primer lugar, el uso del sistema de expresión Gal4-UAS en múltiples configuraciones para genéticamente orgánulos de la etiqueta en tipos celulares específicos. En segundo lugar, una comparación directa de campo amplio y microscopía confocal a las estructuras subcelulares de imagen in vivo.

Las estrategias actuales para modificar genéticamente los orgánulos de la etiqueta y otras estructuras subcelulares en el pez cebra o bien hacer uso de cubiertas de ARNm 1,4,8 o construcciones de ADN basada en elementos promotores conducen directamente la expresión de proteínas de fusión 9,14,15. Transcrito in vitro de ARN en cubiertas resultados rápida y amplia expresión, que no es específica de tejido sin embargo. Además, los niveles de expresión disminuyen con el tiempo que el ARN tapado se diluye o se degrada. Así, el uso de ARN basadoconstruye para examinar la dinámica de orgánulos en las etapas posteriores de desarrollo es limitado (generalmente hasta 3 días después de la fertilización).

Estas limitaciones se pueden superar mediante el uso de construcciones de ADN, donde el control espacial y temporal de la expresión se determina por elementos promotores específicos. Cuando construcciones basadas ADN se utilizan en el contexto del sistema de Gal4-UAS mejoras significativas en los niveles de expresión del transgen se observan 26,27. En este sistema de expresión bipartito, de tipo celular elementos promotores específicos conducir la expresión de un activador transcripcional Gal4, mientras que los genes informadores son clonados aguas abajo de la secuencia de activación aguas arriba Gal4 vinculante (UAS). Mediante la combinación de UAS reporteros con conductores Gal4 apropiadas, la expresión puede limitarse a tipos de células específicos, eludiendo la necesidad de clonar genes informadores detrás de diferentes promotores cada vez que se desea un patrón de expresión específico. Además, la expresión de múltiples genes indicadores UAS puede serimpulsado por un solo activador Gal4. Así, el sistema Gal4-UAS ofrece un enfoque genético versátil y flexible para el etiquetado subcelular.

De gran campo y microscopios confocal son los caballos de batalla de la mayoría de los laboratorios. sistemas de campo amplia suelen utilizar una lámpara de arco como fuente de luz y detectar la luz emitida con una cámara sensible que se coloca al final de la trayectoria de la luz. Esta modalidad de imagen está normalmente restringido a muestras delgadas como fuera de foco luz oscurece la información de enfoque en las muestras más gruesas. Microscopios confocales difieren de los sistemas de campo amplio en el que se construyen para favorecer las señales que se originan en el plano focal sobre los que se originan fuera de foco (es decir, "seccionamiento óptico") 28. Para lograr seccionamiento óptico de un agujero de alfiler se coloca en la trayectoria de emisión en una posición conjugada a la fuente de luz puntual. Los láseres son utilizados como fuentes de luz y las señales se detectan con tubos fotomultiplicadores (PMT). Prácticamente, un láserhaz se desliza sobre la muestra de punto por punto y la emisión de fluorescencia en cada punto (pixel) es detectada por el PMT.

Aquí la imagen de las mismas estructuras subcelulares en embriones de pez cebra de estar utilizando tanto de gran campo y la microscopía confocal para proporcionar una comparación directa de ambas modalidades de microscopía. El objetivo subyacente de proporcionar este tipo de comparaciones es ofrecer directrices para la elección de la técnica de microscopía más apropiada para la cuestión específica que nos ocupa.

El uso de los enfoques descritos aquí demostramos Gal4-UAS etiquetado con base genética de las mitocondrias y los centrosomas. Estos orgánulos son imágenes en diferentes tipos de células del sistema nervioso y en las células musculares usando de campo amplio y microscopía confocal para demostrar la idoneidad de cada modalidad de imagen. Los métodos descritos aquí se pueden adaptar fácilmente para la investigación de otros orgánulos y estructuras subcelulares en el embrión de pez cebra vivo.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las regulaciones locales del gobierno de la Alta Baviera (Munich, Alemania). 1. Etiquetado de orgánulos subcelulares y Otras Estructuras NOTA: Aquí reportero construye genética que se describen membranas centrosomas etiqueta fluorescente, las mitocondrias y los teléfonos. Utilizar métodos de clonación convencionales 29 para generar proteínas de fusión q…

Representative Results

Aquí el uso de campo amplio y microscopía confocal para las mitocondrias de imagen y los centrosomas en embriones de pez cebra que vive está directamente comparado y contrastado. Dependiendo de la localización de las células en las que la dinámica de orgánulos han de ser examinada y la frecuencia propia de los acontecimientos subcelulares específicos, por lo general, ya sea de campo amplio o microscopía confocal es la mejor opción. Nos fotografiado orgánulos en las neuronas RB…

Discussion

Aquí, se demuestra la versatilidad del sistema de expresión Gal4-UAS a las mitocondrias de la etiqueta fluorescente, centrosomas y las membranas celulares de tipos de células específicas in vivo en embriones de pez cebra. Muchas proteínas de fusión fluorescentes que etiquetan otros orgánulos o estructuras subcelulares se pueden encontrar en la literatura publicada y se pueden obtener en el laboratorio respectivo, de fuentes comerciales o depositarios plásmido no comerciales (por ejemplo, Addgen…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

P.E. is supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 and the Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. was supported by TUM-GS. L.T. is supported by an EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013). D.P.’s work on zebrafish was supported by the DFG through the Sonderforschungsbereich “Molecular Mechanisms of Neurodegeneration” (SFB 596); the Center for Integrated Protein Sciences (Munich) and the European Community’s Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant agreement no. 200611 (MEMOSAD). He is currently a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow and was supported by a fellowship from the German Academy of Sciences Leopoldina. L.G. is supported by funding from the DFG through SFB 870 “Assembly and Function of Neuronal Circuits”, Project A11.

We are grateful to Kristina Wullimann for maintaining our fish facility, Yvonne Hufnagel for technical support and Thomas Misgeld for comments on the manuscript. We are grateful to R. Köster (Technische Universität Braunschweig) for providing the M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) from which we cloned out Centrin-YFP and S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for providing the 14xUAS:MA-cerulean cassette which we used to generate the reporter construct to make CentrinFish. We further thank S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for the Otx2:Gal4 transgenic line, A. Sagasti for the Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) and M. Nonet (Washington University in St. Louis) for the pCold Heart Tol2 vector. We acknowledge Bettina Schmid, Alexander Hruscha and Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich – DZNE) for contributing to the development of MitoFish.

Materials

Agarose (2-hydroxyethylagarose) Sigma-Aldrich A4018-10G Low-gelling temperature Type VII
Block heater Eppendorf Thermomixer compact
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996%  Aldrich 202967-50g To prepare 30x Danieau's
CCD camera Qimaging Retiga Exi Fast 1394
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps Dumont – Fine Science Tools 11252-50 #5 Forceps
Confocal laser-scanning microscope Olympus FV1000 Fluoview
Culture dish heater Warner Instrument Corporation DH-35 Heating ring
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt Fluka Analytical A5040-100G Tricaine (anesthetic)
Fluorescence dissecting microscope Leica M205 FA
GeneClean kit MP Biomedicals 111001200
Glass Bottom Culture Dishes MatTek Corporation P35G-0-14-C 35mm petri dish, 14mm microwell, No. 0 coverglass
Glass needles World Precision Instruments Inc.  TW100F-4 For microinjections
HEPES Sigma H3375-250g To prepare 30x Danieau's
High vacuum grease Dow Corning  DCC000001242 150g Silicon dioxide grease
Incubator Thermo Scientific Heraeus To maintain zebrafish embryos at 28.5⁰ C
KCl 99% Sigma-Aldrich S7643-5kg To prepare 30x Danieau's
MgSO4.7H2O   Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent Sigma-Aldrich 230291-500g To prepare 30x Danieau's
Microinjector  Eppendorf FemtoJet
Microloader tips Eppendorf 930001007 0.5-20uL
Micromanipulator Maerzhaeuser Wetzlar MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R
Micropipette holder Intracel P/N 50-00XX-130-1
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Ambion AM1340 To transcribe PCS-Transposase
NaCl BioXtra >99.5% Sigma-Aldrich P9541-1kg To prepare 30x Danieau's
Nanophotometer To measure DNA/RNA concentration
Needle puller Sutter Instrument P-1000 Flaming/Brown
NIR Apo 40x/0.80W  Nikon Water-dipping-cone objective
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% Sigma P7629-10G PTU (prevents pigmentation)
Petri dishes Sarstedt AG  821472 92 x 16mm 
Plastic molds  Adaptive Science Tools TU-1 For microinjections
Plexiglas cover-with a hole Custom-made The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective
Tea-strainer (Plastic) To collect zebrafish eggs
Temperature controller Warner Instrument Corporation TC-344B Dual Automatic Temperature Controller
Transfer pipettes Sarstedt AG  86.1171 3.5mL plastic transfer pipettes
UMPlanFI 100x/1.00W Olympus Water-dipping-cone objective
UMPlanFLN 20x/0.50W  Olympus Water-dipping-cone objective
Widefield microscope Olympus BX51WI
PTU (50x Stock) Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water
Stir vigorously at room temperature 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Tricaine (20x Stock) Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water
Add 2 ml 1M Tris base (pH9)
Adjust to pH 7 
Store at -20 oC in 1 ml aliquots
Use at 1x working solution
Danieau's Solution (30x Stock) 1740 mM  NaCl 
<21 mM      KCl 
12 mM      MgSO4.7H2
18 mM      Ca (NO3)2
150 mM    HEPES buffer 
Distilled water upto 1 L 
Store at 4 o
Use at 0.3x working solution

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Cite This Article
Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo. J. Vis. Exp. (110), e53456, doi:10.3791/53456 (2016).

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