Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.
In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.
Vivo इमेजिंग में सबसे अधिक शारीरिक संदर्भ में सेलुलर व्यवहार के प्रत्यक्ष दृश्य प्रदान करता है। Zebrafish भ्रूण, उनके तेजी से और बाह्य विकास और आनुवंशिक उपकरण है कि फ्लोरोसेंट लेबलिंग की अनुमति के एक अमीर सरणी की पारदर्शिता सभी विवो माइक्रोस्कोपी के बढ़ते उपयोग महत्वपूर्ण विकासात्मक घटनाओं की गतिशीलता को स्पष्ट करने के लिए योगदान दिया है। Zebrafish में तंत्रिका तंत्र के विकास की इमेजिंग अध्ययन उदाहरण के लिए बहुत तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं के व्यवहार और उनके बाद प्रवास, भेदभाव और सर्किट एकीकरण 1-8 सहित उनके संतान के भाग्य के हमारे ज्ञान का विस्तार किया है।
मंच अब इन सेलुलर व्यवहार अंतर्निहित subcellular गतिशीलता की जांच को तैयार है। दरअसल, zebrafish पहले से ही इन विवो कोशिका जीव विज्ञान के लिए उपकरण के रूप में शोषण किया जा रहा है। यह Golgi 15 माइटोकॉन्ड्रिया 9-11 कल्पना करने के लिए अब संभव है, 2,8,12-14 centrosomes,, Microtubule 4 और actin 16 cytoskeleton, 17 endosomes और शिखर झिल्ली के घटक जटिल 1,18, विवो में zebrafish भ्रूण में अन्य subcellular संरचनाओं के बीच में। अब तक, क्या इन अंगों के समारोह के बारे में जाना जाता है के ज्यादा संवर्धित कोशिकाओं में उनके व्यवहार का अध्ययन से आता है। इन विट्रो अध्ययन कोशिका जीव विज्ञान में जबरदस्त अंतर्दृष्टि सामने आए हैं, वहीं संस्कृति में कोशिकाओं को पूरी तरह से इन विवो स्थिति की जटिलता का प्रतिनिधित्व नहीं करते और इसलिए जरूरी समारोह और इन विवो में subcellular अंगों की गतिशीलता को प्रतिबिंबित नहीं करते। Zebrafish भ्रूण subcellular गतिशीलता की जांच करने के लिए विवो विकल्प में एक व्यवहार्य प्रदान करते हैं।
रीढ़ के रूप में, zebrafish कई अंग प्रणालियों (जैसे, तंत्रिका रेटिना) कि स्तनधारी प्रजातियों में पाए जाने वाले के मुताबिक़ के अधिकारी हैं। इसके अतिरिक्त, zebrafish भ्रूण तेजी से मानव रोगों 19,20 मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है </sअप>, centrosomal समारोह (जैसे, microcephaly 21 और लेबर की जन्मजात अंधता 22) और mitochondrial समारोह (जैसे, पार्किंसंस रोग 23, 10,24 और tauopathies बार्थ सिंड्रोम 25) से संबंधित उन सहित। सेलुलर और subcellular स्तर पर vivo इमेजिंग इन मामलों में कोशिका जीव विज्ञान ये रोग राज्यों अंतर्निहित का एक बेहतर समझ की अनुमति होगी।
यहाँ वर्णित विधि के समग्र लक्ष्य विवो प्रकाश माइक्रोस्कोपी में उपयोग कर zebrafish भ्रूण में अंगों और अन्य subcellular संरचनाओं की जांच करने के लिए एक व्यापक मार्गदर्शन प्रदान करने के लिए है। पूरे काम के प्रवाह विवो में visualizing और subcellular संरचनाओं पर नज़र रखने में शामिल वर्णित है – आनुवंशिक लेबलिंग दृष्टिकोण से, क्षणिक पैदा व्यक्त करने और स्थिर ट्रांसजेनिक मछली, और अंत में व्यापक क्षेत्र और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग इमेजिंग के लिए करने के लिए। इन proc के प्रत्येक जबकिedures कई zebrafish प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया जाता है, प्रोटोकॉल वर्णित अनुकूलित और subcellular संरचनाओं की गतिशीलता की जांच के लिए चुस्त कर रहे हैं। काम यहाँ वर्णित के दो विशिष्ट पहलुओं वारंट उल्लेख: सबसे पहले, विशेष सेल-प्रकार में आनुवंशिक रूप से लेबल अंगों के लिए कई विन्यास में Gal4 यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करें। दूसरा, एक प्रत्यक्ष विवो में छवि subcellular संरचनाओं के लिए व्यापक क्षेत्र और confocal माइक्रोस्कोपी की तुलना।
आनुवंशिक रूप से लेबल organelles और zebrafish में अन्य subcellular संरचनाओं के लिए वर्तमान रणनीतियों या तो छाया हुआ mRNA 1,4,8 या डीएनए आधारित निर्माणों का उपयोग जहां प्रमोटर तत्वों सीधे संलयन प्रोटीन में 9,14,15। इन विट्रो लिखित छाया शाही सेना परिणामों की अभिव्यक्ति ड्राइव तेजी से और व्यापक अभिव्यक्ति, कि हालांकि ऊतक विशेष नहीं है। इसके अतिरिक्त, अभिव्यक्ति के स्तर समय के साथ कम के रूप में छाया शाही सेना पतला या अपमानित किया जाता है। इस प्रकार शाही सेना के इस्तेमाल के आधार पर(आमतौर पर 3 दिनों के बाद निषेचन) के विकास में बाद के चरणों में organelle गतिशीलता सीमित है जांच करने के लिए निर्माण करती है।
इन सीमाओं डीएनए निर्माणों, जहां अभिव्यक्ति के स्थानिक और लौकिक नियंत्रण विशिष्ट प्रमोटर तत्वों द्वारा निर्धारित किया जाता है का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। डीएनए आधारित निर्माणों transgene अभिव्यक्ति के स्तर को Gal4 यूएएस प्रणाली महत्वपूर्ण सुधार के संदर्भ में इस्तेमाल किया जाता है जब 26,27 मनाया जाता है। इस द्विपक्षीय अभिव्यक्ति प्रणाली में, सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटर तत्वों, एक transcriptional उत्प्रेरक Gal4 की अभिव्यक्ति ड्राइव, जबकि रिपोर्टर जीन Gal4 बाध्यकारी नदी के ऊपर सक्रिय अनुक्रम (यूएएस) के बहाव के क्लोन कर रहे हैं। उचित Gal4 चालकों के साथ यूएएस संवाददाताओं के संयोजन से, अभिव्यक्ति, विशिष्ट सेल प्रकार के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है विभिन्न प्रमोटरों के पीछे हर बार एक विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न वांछित है रिपोर्टर जीन क्लोन करने की जरूरत circumventing। इसके अलावा, कई यूएएस रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति हो सकती हैएक भी Gal4 उत्प्रेरक द्वारा संचालित। Gal4 यूएएस प्रणाली इस प्रकार subcellular लेबलिंग के लिए एक बहुमुखी और लचीला आनुवंशिक दृष्टिकोण प्रदान करता है।
वाइड-फील्ड और confocal सूक्ष्मदर्शी सबसे प्रयोगशालाओं के workhorses हैं। वाइड-फील्ड प्रणाली आम तौर पर एक प्रकाश स्रोत के रूप में एक चाप दीपक का उपयोग करें और एक संवेदनशील कैमरा है कि प्रकाश पथ के अंत में रखा जाता है के साथ उत्सर्जित प्रकाश का पता लगाने। इस इमेजिंग साधन आम तौर पर पतली नमूने के लिए प्रतिबंधित कर के रूप में बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश को धुंधला कर मोटा नमूनों में में फोकस जानकारी है। Confocal सूक्ष्मदर्शी व्यापक क्षेत्र है कि सिस्टम में वे संकेत है कि उन है कि फोकस (यानी, "ऑप्टिकल सेक्शनिंग"), 28 से बाहर उत्पन्न खत्म फोकल हवाई जहाज़ से उत्पन्न पक्ष में करने के लिए बनाया जाता है से भिन्न होते हैं। ऑप्टिकल सेक्शनिंग प्राप्त करने के लिए एक पिनहोल बिन्दु प्रकाश स्रोत के लिए एक साधना स्थिति में उत्सर्जन पथ में रखा गया है। लेजर प्रकाश स्रोत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं और संकेत photomultiplier ट्यूब (PMTs) के साथ पाया जाता है। व्यावहारिक रूप से, एक लेजरकिरण बिंदु से बिंदु और प्रत्येक स्थान (पिक्सेल) में प्रतिदीप्ति उत्सर्जन पीएमटी से पता चला है नमूना भर swiped है।
यहाँ हम दोनों की छवि माइक्रोस्कोपी के तौर तरीकों की एक प्रत्यक्ष तुलना प्रदान करने के लिए दोनों व्यापक क्षेत्र और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग zebrafish भ्रूण जीने में बहुत ही subcellular संरचनाओं। इस तरह की तुलना को उपलब्ध कराने के मूल उद्देश्य के हाथ में विशिष्ट प्रश्न के लिए सबसे उपयुक्त माइक्रोस्कोपी तकनीक को चुनने के लिए दिशा निर्देश प्रदान करने के लिए है।
दृष्टिकोण यहाँ वर्णित हम माइटोकॉन्ड्रिया और centrosomes की Gal4 यूएएस आधारित आनुवंशिक लेबलिंग प्रदर्शित का उपयोग करना। इन अंगों प्रत्येक इमेजिंग साधन की उपयुक्तता प्रदर्शित करने के लिए व्यापक क्षेत्र और confocal माइक्रोस्कोपी का उपयोग तंत्रिका तंत्र की और मांसपेशियों की कोशिकाओं में अलग सेल-प्रकार में imaged हैं। यहाँ वर्णित विधि आसानी से रहने वाले zebrafish भ्रूण में अन्य अंगों और subcellular संरचनाओं की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
यहाँ, हम fluorescently टैग माइटोकॉन्ड्रिया, centrosomes और सेलुलर zebrafish भ्रूण में vivo में विशेष सेल प्रकार की झिल्ली Gal4 यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली की बहुमुखी प्रतिभा का प्रदर्शन। कई फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन है कि अन्य ?…
The authors have nothing to disclose.
P.E. is supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Research Training Group 1373 and the Graduate School of the Technische Universität München (TUM-GS). G.P. was supported by TUM-GS. L.T. is supported by an EMBO fellowship (EMBO ALTF 108-2013). D.P.’s work on zebrafish was supported by the DFG through the Sonderforschungsbereich “Molecular Mechanisms of Neurodegeneration” (SFB 596); the Center for Integrated Protein Sciences (Munich) and the European Community’s Seventh Framework Programme (FP7/2007-2013) under Grant agreement no. 200611 (MEMOSAD). He is currently a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow and was supported by a fellowship from the German Academy of Sciences Leopoldina. L.G. is supported by funding from the DFG through SFB 870 “Assembly and Function of Neuronal Circuits”, Project A11.
We are grateful to Kristina Wullimann for maintaining our fish facility, Yvonne Hufnagel for technical support and Thomas Misgeld for comments on the manuscript. We are grateful to R. Köster (Technische Universität Braunschweig) for providing the M1 Medusa vector (pSKmemmRFP:5xUAS:H2B-CFP:5xUAS:Centrin2-YFP) from which we cloned out Centrin-YFP and S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for providing the 14xUAS:MA-cerulean cassette which we used to generate the reporter construct to make CentrinFish. We further thank S.C. Suzuki and T. Yoshimatsu (University of Washington) for the Otx2:Gal4 transgenic line, A. Sagasti for the Sensory:Gal4-VP16 construct (UCLA) and M. Nonet (Washington University in St. Louis) for the pCold Heart Tol2 vector. We acknowledge Bettina Schmid, Alexander Hruscha and Christian Haass (German Center for Neurodegenerative Diseases Munich – DZNE) for contributing to the development of MitoFish.
Agarose (2-hydroxyethylagarose) | Sigma-Aldrich | A4018-10G | Low-gelling temperature Type VII |
Block heater | Eppendorf | Thermomixer compact | |
Ca(NO3)2 Calcium nitrate hydrate, 99.996% | Aldrich | 202967-50g | To prepare 30x Danieau's |
CCD camera | Qimaging | Retiga Exi Fast 1394 | |
Ceramic Coated Dumont #5 Forceps | Dumont – Fine Science Tools | 11252-50 | #5 Forceps |
Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000 Fluoview | |
Culture dish heater | Warner Instrument Corporation | DH-35 | Heating ring |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfate salt | Fluka Analytical | A5040-100G | Tricaine (anesthetic) |
Fluorescence dissecting microscope | Leica | M205 FA | |
GeneClean kit | MP Biomedicals | 111001200 | |
Glass Bottom Culture Dishes | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | 35mm petri dish, 14mm microwell, No. 0 coverglass |
Glass needles | World Precision Instruments Inc. | TW100F-4 | For microinjections |
HEPES | Sigma | H3375-250g | To prepare 30x Danieau's |
High vacuum grease | Dow Corning | DCC000001242 150g | Silicon dioxide grease |
Incubator | Thermo Scientific | Heraeus | To maintain zebrafish embryos at 28.5⁰ C |
KCl 99% | Sigma-Aldrich | S7643-5kg | To prepare 30x Danieau's |
MgSO4.7H2O Magnesium sulfate heptahydrate 98+% A.C.S reagent | Sigma-Aldrich | 230291-500g | To prepare 30x Danieau's |
Microinjector | Eppendorf | FemtoJet | |
Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | 0.5-20uL |
Micromanipulator | Maerzhaeuser Wetzlar | MM33 Rechts/00-42-101-0000/M3301R | |
Micropipette holder | Intracel | P/N 50-00XX-130-1 | |
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | To transcribe PCS-Transposase |
NaCl BioXtra >99.5% | Sigma-Aldrich | P9541-1kg | To prepare 30x Danieau's |
Nanophotometer | To measure DNA/RNA concentration | ||
Needle puller | Sutter Instrument | P-1000 | Flaming/Brown |
NIR Apo 40x/0.80W | Nikon | Water-dipping-cone objective | |
N-Phenylthiourea Grade I, approx. 98% | Sigma | P7629-10G | PTU (prevents pigmentation) |
Petri dishes | Sarstedt AG | 821472 | 92 x 16mm |
Plastic molds | Adaptive Science Tools | TU-1 | For microinjections |
Plexiglas cover-with a hole | Custom-made | The hole in the Plexiglas cover should be 3 mm larger than the diameter of the water-dipping-cone objective | |
Tea-strainer (Plastic) | To collect zebrafish eggs | ||
Temperature controller | Warner Instrument Corporation | TC-344B | Dual Automatic Temperature Controller |
Transfer pipettes | Sarstedt AG | 86.1171 | 3.5mL plastic transfer pipettes |
UMPlanFI 100x/1.00W | Olympus | Water-dipping-cone objective | |
UMPlanFLN 20x/0.50W | Olympus | Water-dipping-cone objective | |
Widefield microscope | Olympus | BX51WI | |
PTU (50x Stock) | Dissolve 76 mg PTU in 50 ml distilled water Stir vigorously at room temperature Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution |
||
Tricaine (20x Stock) | Dissolve 200 mg Tricaine in 48 ml distilled water Add 2 ml 1M Tris base (pH9) Adjust to pH 7 Store at -20 oC in 1 ml aliquots Use at 1x working solution |
||
Danieau's Solution (30x Stock) | 1740 mM NaCl <21 mM KCl 12 mM MgSO4.7H2O 18 mM Ca (NO3)2 150 mM HEPES buffer Distilled water upto 1 L Store at 4 oC Use at 0.3x working solution |