Neuronal Tracing en explantes cerebrales guiadas por láser

Con el fin de definir un cierto (micro) circuito neuronal, hay que empezar por encontrar los diversos participantes de dicho circuito, y su patrón de conexión. Desde la publicación de Waller sobre neurofiber rastreo a través lesioning ¹ una gran variedad de técnicas de rastreo neuroanatómicas ha sido establecida. Algunas de estas técnicas se pueden aplicar en el tejido fijado post mortem ^2-4, otros se basan en el transporte activo del colorante en neuronas vivas, como descubierto en 1971 ^6.5. Este último puede subdividirse en dos grupos que discriminan entre los métodos que se aprovechan de retrógrado activo (a partir de la zona de inyección a la fuente de una proyección dada, es decir. La somata de las neuronas que se proyectan hacia dicha zona) y anterógrada activo (desde el inyectada área a la diana de una proyección dada, es decir. las proyecciones axonales y los terminales axonales de las neuronas marcadas) de transporte. También, en algunos casos tramaterial de cer se inyecta en animales vivos que luego sobreviven a la inyección por varios días o semanas (en inyecciones de trazadores vivo), mientras que en otros casos se inyectan cerebros explantadas e incubar durante varias horas después de la inyección en el líquido cefalorraquídeo artificial (in vitro inyecciones de trazadores) .

En este protocolo se modificó una existente en la técnica de electroporación in vitro ^7.8 para etiquetar somata y procesos neuronal en anterógrada y retrógrada rastreo experimentos utilizando dextrano choleratoxin subunidad-b y tetrametilrodamina como las sustancias de rastreo. El objetivo general de este protocolo es proporcionar neurocientíficos con una herramienta eficiente para rastrear los patrones de conectividad neuronal entre los diferentes núcleos del cerebro, mientras que el aprovechamiento de líneas de ratones transgénicos disponibles y equipos ópticos básica con el fin de aumentar la precisión de la orientación durante las inyecciones de trazadores. Aunque el método de anterógrada y rastreo retrógrado utilizandocholeratoxin y la amina dextrano y sus respectivos conjugados marcados con fluorescencia no es ^NUEVO 9-13 (como es el método de electroporación, por ejemplo. Haas et al. ^14), la combinación de las inyecciones de trazadores con la electroporación en una preparación in vitro que implica bloques de tejido cerebral es un desarrollo más reciente ^7. Su principal ventaja sobre las técnicas de rastreo neuronales utilizando el mismo tipo de colorantes trazadores de animales vivos es la mayor intensidad de etiquetado, debido a la mayor eficiencia con la que el colorante a electroporación está siendo tomada por las neuronas. Una ventaja adicional es el período acortado de incubación (requerido para el transporte de colorante) y su mayor precisión de destino durante la inyección del marcador, porque el experimentador tiene el control visual sobre el área objetivo de la inyección. Este último también significa que no se requiere equipo caro estereotáctica para encontrar el área núcleo o el cerebro de interés.

Para adinalmente aumentar precisión de la focalización, nos aprovechamos de una línea de ratón transgénico, que expresa GFP en su subpoblación glicinérgica de neuronas ¹⁵ y equipos ópticos básicos que consisten en un puntero láser de mano de 405 nm gafas de filtro de longitud de onda y la congruencia de banda de paso (450 – 700 nm). De este modo, logramos un mayor aumento significativo en la precisión de la focalización mediante la identificación de la zona de inyección a través de su señal fluorescente y proporcionando una manera más fina para controlar la propagación de colorante dentro del área de inyección a través de la observación de la interacción entre la señal de GFP indígena y el trazador fluorescencia. Nuestra técnica también permite descubrir la funcionalidad de un circuito junto con su conectividad mediante la identificación de las neuronas inhibitorias GFP-positivas (o excitatorio en otras líneas de ratón) que se llena con el trazador.

En resumen, hemos mejorado aún más una poderosa herramienta neurocientífica para estudiar el conectoma del cerebro de los vertebrados y evaluar tque diferentes características neuroanatómicas de un neurocircuit dado. Mediante el uso de ratones transgénicos, junto con equipos ópticos de bajo costo y ampliamente disponible pudimos aumentar significativamente la precisión de la focalización de nuestras inyecciones. Además, los ratones transgénicos nos permitió identificar el tipo de las conexiones trazadas, lo que ayudó descubrir la funcionalidad de un microcircuito inhibitorio en el tronco cerebral auditivo.