This manuscript describes how to conduct (single molecule) Förster Resonance Energy Transfer (FRET)- based assays to measure the binding dynamics between T-cell antigen receptor (TCR) and antigenic peptide-loaded MHC molecules as they occur within the immunological synapse of a T-cell in contact with a functionalized planar supported lipid bilayer.
T-cells are remarkably specific and effective when recognizing antigens in the form of peptides embedded in MHC molecules (pMHC) on the surface of Antigen Presenting Cells (APCs). This is despite T-cell antigen receptors (TCRs) exerting usually a moderate affinity (µM range) to antigen when binding is measured in vitro1. In view of the molecular and cellular parameters contributing to T-cell antigen sensitivity, a microscopy-based methodology has been developed as a means to monitor TCR-pMHC binding in situ, as it occurs within the synapse of a live T-cell and an artificial and functionalized glass-supported planar lipid bilayer (SLB), which mimics the cell membrane of an Antigen presenting Cell (APC) 2. Measurements are based on Förster Resonance Energy Transfer (FRET) between a blue- and red-shifted fluorescent dye attached to the TCR and the pMHC. Because the efficiency of FRET is inversely proportional to the sixth power of the inter-dye distance, one can employ FRET signals to visualize synaptic TCR-pMHC binding. The sensitive of the microscopy approach supports detection of single molecule FRET events. This allows to determine the affinity and off-rate of synaptic TCR-pMHC interactions and in turn to interpolate the on-rate of binding. Analogous assays could be applied to measure other receptor-ligand interactions in their native environment.
Une compréhension plus fondamentale de la façon dont les cellules T reconnaissent les antigènes, il faut regarder au bon endroit, qui est, au sein de la synapse immunologique formé entre la cellule T et l'APC. Ici, la cinétique de liaison moléculaires ne sont pas seulement déterminées par les propriétés biochimiques intrinsèques des partenaires d'interaction en cause, mais dépend dans une large mesure, de paramètres cellulaires qui comprennent des forces cellulaires, l'architecture de la membrane et des interactions latérales entre protéines membranaires ainsi que les contraintes géométriques spécifiques synapse 3. Approches biochimiques sont limités en puissance de résolution car ils nécessitent l'interruption d'au moins une des membranes synaptiques concernées. Pour cette raison, une méthode d'imagerie basée FRET a été développé pour surveiller la liaison du TCR à pMHCs antigéniques 2. Voici cellules T sont décorées avec un recombinant et site spécifiquement étiquetés TCRβ-réactive chaîne unique fragment d'anticorps (SCF V) et confrontés avec le plan ar bicouches lipidiques verre soutenu (SLBS), qui abritent des molécules du CMH de classe II chargées avec un peptide antigénique marqué par fluorescence, les molécules de co-stimulation et des protéines d'adhésion. Synaptic liaison entre les résultats pMHC marqués par un colorant TCR et marqué par un colorant dans FRET, qui peuvent être surveillés sur un vrac et le niveau de la molécule unique par fluorescence à réflexion interne totale (FRBR) microscopie.
Dans cet article, il est expliqué en détail comment utiliser SLBS pour doser synapses des cellules T, vérifier leur intégrité à travers un dosage de calcium-flux T-cellule fonctionnelle, la conduite de FRET mesures en vrac et à la sensibilité de la molécule unique, et d'analyser les données acquises. Recommandations sont offerts à la production de protéines correctement conformés requises pour bicouche fonctionnalisation. Pour des informations plus spécifiques concernant la formation de bicouche et la configuration d'un microscope de la FRBR appropriée s'il vous plaît se référer à un accès public publication JoVE supplémentaire publiée dos à dos 4.
tente "> Nature de SLBSSLBS fonctionnalisables peuvent être facilement générés à partir de vésicules unilamellaires (SUV) contenant les deux lipides-2-oléoyl-sn-gylcero-3-phosphocholine 1-palmitoyl (courte: POPC, 90-99%) et 1,2 sn-dioleoyl- – glycéro-3 – {[N (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacétique acide] succinyl} (courte: DGS NTA-Ni, 1-10%). VUS étalées sur des lames de verre propres pour former une bicouche plane contiguë 4. DGS-NTA-Ni sert à ancrer les protéines à marquage polyhistidine via la formation de complexe-polyhistidine médiée par la synthèse NTA-Ni contenant un groupe de tête (figure 1A). Pour association stable, on le remplace généralement le domaine transmembranaire natif et la queue cytoplasmique de la protéine d'adhésion ICAM-1 et la molécule de co-stimulation B7-1 avec une étiquette contenant douze histidines (ICAM-1-12H, -12H B7-1) (figure 1B) . Le peptide-molécule de classe II chargé IE k contient deux chaînes de polypeptide membranaire incorporé (α et β)s. Les transmembranaires / domaines cytoplasmiques de deux chaînes doivent être remplacés avec une étiquette contenant six histidines chaque (IE k α β 6H 6H ou IE k -2x6H). En variante, l'extension de la chaîne α-douze histidines et en laissant le domaine extracellulaire de la chaîne β-non marqué (donnant lieu à des α k IE 0H 12H β ou IE -12H k) donne lieu à des résultats satisfaisants (figure 1B).
Étiquetage des pMHCs spécifique au site
Il est important de marquer le pMHC stoechiométriquement et spécifique au site afin d'être en mesure de convertir mesurées FRET rendements dans des constantes de liaison d'équilibre significatives. Ceci peut être réalisé par marquage chimique d'un peptide synthétique qui est chargé dans la fente de l'histidine recombinante étiquetée du CMH de classe II de 2,5 molécules de liaison peptidique. Le peptide comprend tous les résidus de l'épitope de cellule T comme well comme un C-terminal de liaison courte (GGS), suivie par la cystéine (par exemple dans la teigne du cytochrome c (MCC) peptide ANERADLIAYLKQATK- GGSC, le linker est marquée en gras). Cette cystéine est utilisé pour marquer le peptide stoechiométriquement avec l'utilisation de dérivés de maléimide colorant. À ce stade soin supplémentaire devrait être consacrée à la vérification quantitative colorant couplage au peptide contenant de la cystéine. HPLC-purification du produit d'addition de peptide-colorant est recommandé et doit être suivie par spectroscopie de masse à ionisation électrospray. Toute masses enregistrées correspondant au produit de départ de peptide (sans colorant) reflètent l'étiquetage incomplet. Si cela est vrai, le peptide purifié par HPLC doit être soumis à des cycles de colorant étiquetage consécutifs jusqu'à ce que l'étiquetage est considéré quantitative. A noter que la spectroscopie de masse MALDI-TOF doit être évitée car ce procédé implique un rayonnement laser pour l'ionisation échantillon. Ce traitement se désintègre les fluorophores sensibles attachés avant la messe de peptide est lue et donc underrepre sente degrés de colorant conjugaison.
Marquage indirect instant spécifique de site de cellules TCR lié à l'utilisation de fragments monovalents à chaîne unique Fv
Il est encore difficile de fixer des colorants à la cellule des protéines des cellules vivantes surface associée d'une manière spécifique au site. Pour surmonter cet obstacle pour les TCR de surface exposé, une version monovalent à chaîne unique (scFv V) à partir des gènes de l'anticorps monoclonal TCRβ -reactive H57-197 2 a été construit. La structure cristalline de cet anticorps dans un complexe avec le TCR permet de concevoir rationnellement une version, dans lequel un résidu de serine à proximité immédiate de l'extrémité C-terminale du peptide associé au CMH (lorsque le partenaire colorant FRET correspondant est attaché) est remplacé par un résidu cystéine. Ce mutant cysteine sert alors d'accepteur de colorant pour la conjugaison (figure 2).
Méthodologies d'enregistrer FRET
nt "> Les valeurs de FRET en vrac sont les mieux adaptés à vérifier la relation entre les distances inter-colorants choisis et FRET efficacité mesurés dans cette TCR-pMHC système de liaison 2. En outre, les mesures de FRET en vrac révèlent des différences qualitatives et quantitatives dans synaptiques affinités TCR-pMHC ( voir ci-dessous et la section de protocole 3.2). Différentes approches pour quantifier l'efficacité de FRET ont été introduites dans la littérature 6. Dans cet article FRET est enregistrée via(a) la récupération de donneur après accepteur blanchiment, et via
(b) sensibilisé FRET accepteur émission.
Le premier procédé (a) nécessite l'utilisation d'un accepteur de FRET qui peut être facilement décolorées, et d'un donneur, qui est plutôt photostable. En outre, il est important de veiller à ce que l'accepteur décolorées est plus capable d'éteindre la fluorescence du donneur. Comme le même canal de détection (donneur) est utilisée pour la quantification, un pas de facteurs de correctiond aucun aberrations chromatiques doivent être considérées, ce qui rend cette simple méthodologie et fiable. Cependant, les mesures quantitatives ne peuvent pas être répétées au même endroit de l'échantillon et les changements de FRET ne peuvent pas être enregistrées au fil du temps. Pour éviter les effets causés par la diffusion moléculaire ou la motilité cellulaire une étape de blanchiment rapide doit être recherché, ce qui minimise le temps qui passe entre le premier donneur de FRET (avant accepteur blanchiment) et la seconde image acquisition FRET donneur (après FRET accepteur blanchiment). Il est recommandé d'utiliser une source de lumière laser puissant du FRET accepteur d'onde d'excitation afin de minimiser éclairage et de blanchiment fois.
En revanche, dans l'approche de la mesure de FRET de l'émission sensibilisée (b) le donneur FRET est excité et l'émission de l'accepteur de FRET est observé dans le canal d'accepteur FRET. Changements dans signal d'accepteur FRET peuvent être enregistrées au fil du temps, mais émission du donneur FRET dans le canal accepteur décalée vers le rouge (termed bleedthrough) et accepteur FRET croix-excitation via donateurs excitation doit être déterminé et soustrait du canal accepteur FRET correctement enregistrée. Pour cela, les images d'accepteur FRET FRET donneur correspondant et doivent être alignés spatialement.
Détection de molécule unique (sm) FRET événements
Avec l'utilisation des lasers en tant que source d'excitation, et une caméra sensible microscopie TIRF de bruit atténué la fluorescence de fluorophores simples peuvent être facilement tracé au fil du temps. Similaire est vrai pour la détection d'événements de smFRET intermoléculaires. Toutefois, des complications peuvent être causés par FRET bleedthrough des bailleurs de fonds et de contre-excitation de l'accepteur de FRET, et donc le plus grand soin doit être pris lors de l'ajustement des densités de fluorophores dans l'expérience smFRET.
Dans le protocole ci-dessous (section 4 du protocole) du TCR a été choisi comme donneur de FRET en haute abondance et pMHC comme accepteur FRET en faible abondance. Pour atténuer FRET donateurs bleedthrough suffisamment, décorer 10-30% des TCR avec fluorescente scF V et 90-70% des TCR avec des non-fluorescente scF V. Voici le canal accepteur FRET a été choisi comme canal de la molécule unique, car il est confocale avec le seule molécule FRET canal. Cela permet d'aligner événements smFRET avec une seule molécule FRET accepteurs, qui est la base de la validation smFRET.
Extraction hors-taux synaptiques par des mesures smFRET
Photoblanchiment des deux FRET donneur et accepteur FRET doivent être pris en compte lors de l'extraction de la demi-vie des interactions de molécule unique FRET traces. Le nombre de FRET signaux observables au début de leur apparition en tant que seule paire donneur-accepteur N (0) est réduite au fil du temps à la fois par la déliaison du photoblanchiment complexe et récepteur-ligand. Le nombre de survivants complexes à un moment donné N (t) peut être exprimée mathématiquement comme suit:
<p class = "jove_content">Dans le terme exp de photoblanchiment (-t / τ de blanchiment), le temps t est décrit par le produit du nombre d'observations n et l'illumination temps t mauvais à cause du mode d'observation non continue, discrets (par exemple, la décoloration ne se produit que pendant l'illumination ). Dans le EXP- cinétique à long terme (t / τ off) le temps t est le produit du nombre d'observations n et t le temps de retard pour une seule observation de FRET (c.-à-déliaison cinétique se produit en continu). L'équation 1 peut être exprimée comme:
Le terme τ eau de Javel / τ des maladescribes le nombre d'observations jusqu'au blanchissement se produit et est défini comme la valeur moyenne <n blanchir> de sa fonction exponentielle. L'équation 2 peut être simplifiée comme suit:
La valeur moyenne <n (t lag)> du nombre d'images N (t) avec FRET événements observables après l'instant t est déterminé directement à partir de l'expérience. Il dépend du temps réglable entre les observations (T lag) choisis dans l'expérience et les valeurs inconnues pour τ off (l'inverse de la vitesse de dissociation k off) et <n blanchir>, la valeur moyenne du nombre d'observations avant le blanchiment se produit .
Ainsi, le calcul de la valeur moyenne <n (t de latence)> pendant au moins deux valeurs de t <sub> décalage permet la détermination expérimentale de <n blanchir> et T pour off.
L'extraction de valeurs synaptiques 2D-K D par des mesures sur la base de FRET-
Mesure TCR occupation d'un, à savoir le rapport entre le TCR et TCR consolidés totaux, est essentiel pour la détermination des valeurs synaptiques 2D-K D. Selon l'équation 4 ce terme est directement proportionnelle à la mesure FRET céder tant que TCR sert donateurs et pMHCs comme accepteurs FRET FRET.
avec une occupation = TCR, C = facteur de conversion
C est une constante qui dépend du système de FRET et les fluorophores utilisés. Il peut être déterminé expérimentalement, comme indiqué ci-dessous. un peut être converti en un 2D-K D conformément à l'équation 5 lorsque ledensité initiale de ligands de TCR avant l'addition des cellules T à la bicouche est connue. Ceci est dû à la forte mobilité des protéines SLB-jointes et aussi parce que SLBS fournir un réservoir presque inépuisable de ligands 2.
avec [initial pMHC] = densité initiale de pMHC avant l'addition des cellules T
Avec équations 4 et 5, on peut maintenant facilement déterminer la synaptique 2D-K D entre TCR et pMHC. Ceci est le plus fiable fait avec des mesures de FRET à base de récupération de donneur après accepteur blanchiment (voir la section de protocole 3.1).
Cependant, pour mesurer C la relation entre l'intensité de FRET je FRET (corrigé pour le fond, FRET bleedthrough donneur et accepteur FRET croix-excitation) et TCR occupation A doit être déterminée. Pour cela, unea besoin de connaître le rapport R entre l'intensité de fluorescence moyenne de fluorophores simples TCR-associés FRET donateurs (par exemple Cy3 ou AF555) sm je donneur de FRET et l'intensité moyenne de la molécule unique FRET événements sm i FRET. R dépend du système de FRET en question, les filtres d'émission et de la caméra utilisée pour la détection de fluorescence.
Le TCR OCCUPATION un peut alors être directement déterminé selon l'équation 6.
avec R = sm je donneur de FRET / sm je FRET
R a été déterminée comme 1,45 pour le système H57 scFv Cy3 / Cy5-pMHC conduit à:
a = vrac je FRET / vrac je TCR-cy3 • 1,45
La relation entre le taux d'occupation des TCR a et le rendement de FRET peut être déterminée par FRET donneur récupérery accepteur après blanchiment. Pour ces deux paramètres sont tracés les uns contre les autres pour un certain nombre de TCR microamas comme représenté sur la figure 4A .La pente de la régression linéaire indique le facteur de conversion C (à partir de l'équation 4).
Comme le montre la figure 4A, C représente pour (a) le scFv V H57 – Cy3 / Cy5-pMHC système FRET et (b) la configuration du système de microscope appliqué à 1,995. Le TCR occupation d'un peut être facilement déduit comme suit:
Occupation du TCR a = FRET céder • 1.995
Mesure interactions protéine-protéine in situ est très souhaitable en particulier lorsque le traitement avec des interactions de faible affinité tels que TCR-pMHC de liaison 11. Ceci parce que le taux ainsi que sur la stabilité de ces interactions sont fortement influencés par les circonstances particulières dans lesquelles la liaison a lieu. Des approches d'imagerie à base de FRET mini-invasives sont donc en principe parfaitement adapté pour de telles tâches, mais impliquent un certain nombre d'obstacles qui doivent d'abord être surmontés. Le bruit généré par autofluorescence cellulaire limite la sensibilité des mesures et doit donc être maintenu à un minimum. Microscopie FRBR sert ce besoin très bien 12 mais nécessite la fonctionnalisation de verre-diapositives, idéalement sous la forme d'un plan de verre soutenue bicouche lipidique décorée avec des protéines de choix 13-15. Un autre avantage d'une approche en partie reconstitutive est que les partenaires de FRET bicouches-résident recombinants peuvent être beaucoup mle minerai facilement marqué dans un, spécifique au site de manière rationnelle et quantitative avec des fluorophores plus petits et plus lumineux que ce qui serait possible avec des protéines exprimées à la surface des cellules. TCR sont étiquetés avec SCF recombinant V s, qui ne sont pas d'influence sur la reconnaissance des cellules T, comme cela a été précédemment testé deux. En outre, la composition protéique de la SLB, par exemple la densité de pMHCs et le choix des éléments accessoires peut être ajustée à ses besoins spécifiques. Nous avons déjà réalisé des expériences avec des densités de pMHCs stimulateurs varier, mais avons pas détecté de différences significatives en 2D-k off et 2D-K D 2.
Jusqu'à présent, ici la reconnaissance des molécules du CMH de classe II a été traitée avec seulement, principalement en raison de la nature de leur fente de liaison peptidique, qui est ouvert aux deux extrémités et reçoit donc des peptides plus grands, y compris un agent de liaison pour la fixation de fluorophore. Dans certains cas, cette approche pourrait également travailler pour l'étiquetage CMH class je molécules 16, mais une grande prudence devraient être prises pour vérifier leur utilisation dans des expériences. La sensibilité des cellules T à l'égard des antigènes, qui peuvent être mesurés par des tests de prolifération des cellules T, ainsi que la cinétique de liaison pMHC-TCR telle que mesurée in vitro par résonance plasmonique de surface ne doit pas être affectée par l'addition de l'agent de liaison et un fluorophore à le peptide. Alternativement, CMH de classe I se molécules peuvent être étiqueté d'une manière spécifique au site avec l'introduction d'une cystéine non apparié dans la séquence de la chaîne lourde (observations non publiées).
Avec l'utilisation de sondes moléculaires appropriés toute interaction protéine-protéine synaptique peut en principe être étudié de façon que décrit ici. Ces sondes, par exemple, le SCF V s ou des protéines Conçu Ankyrin de répétition (DARPins) 17, devraient être monovalent et doivent lier leur cible de manière stable sans affecter l'interaction d'intérêt. Bien sûr, informatio structurellen est hautement souhaitable pour la conception de la sonde rationnelle mais pas absolument nécessaire. Lors de l'établissement d'une nouvelle paire de partenaires de FRET, il est recommandé d'enregistrer et d'analyser FRET en vrac premier. Les sites d'attachement de l'étiquette peuvent varier considérablement à maximiser le signal de FRET et aussi pour vérifier que les rendements mesurés FRET diffèrent en fonction de la distance inter-colorant. Une fois que le système est optimisé, seule molécule FRET signaux peuvent être enregistrés en limitant l'étiquetage de la forte abondance FRET partenaire à 10-30% et de blanchiment de la faible abondance FRET partenaire jusqu'à molécules simples peuvent être résolus dans le domaine de l'éclairage.
Last but not least, il convient de noter que SLBS rapprochant certains, mais pas tous les aspects d'une membrane plasmique physiologique. Des qualités telles que la courbure de la membrane et la flexibilité, domaine cloisonnement, réarrangements du cytosquelette et la motilité cellulaire ainsi que d'une grande variété de protéines membranaires exprimées en surface ne sont pas représentés par SLBS mais pourraient influencer til traiter sous enquête. Beaucoup d'efforts devront être investis pour établir des modalités d'imagerie qui permettent la surveillance interactions protéine-protéine avec une résolution de la molécule unique dans les synapses physiologiques, qui sont inaccessibles à l'imagerie de la FRBR.
The authors have nothing to disclose.
MA a été soutenue par une bourse de Schrödinger du Fonds scientifique autrichien (FWF, J3086-B11) et remercie la Max-Planck-Society for soutien financier et administratif. GS et JH ont été soutenus par le Fonds Science et technologie de Vienne (WWTF, LS13-030).
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Sf900 II | Life Technologies | 10227402 | insect cell media for baculo virus production |
Insect-XPRESS with L-glutamine (Lonza) | Fisher Scientific | 10564038 | insect cell media for baculo virus expression |
Sf9 cells | Life Technologies | 11496-015 | cells for virus production and expansion |
High Five Cells | Life Technologies | B855-02 | cells for potein expression |
LB-media | Fisher Scientific | 10000713 | bacterial expression |
Centramate System | Pall | protein concentartion from large volumes | |
Centramate cassette 10kDa cutoff | Pall | OS010T12 | protein concentartion from large volumes |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMD Millipore | UFC900308 | protein concentartion |
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Amicon Stirred Ultrafiltration Cell Model 200 mL | EMD Millipore | 5123 | protein concentartion |
Äkta pure 25L | GE Healthcare | 29-0182-24 | protein purification |
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Ni Sepharose 6 Fast Flow | GE Healthcare | 17-5318-01 | protein purification |
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Pursuit XRs C18, 5 µm particle size, 21.2*50 mm column size | Agilent | A6000050G212 | purificationof fluorochrome-coupled peptides |
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Cy3 maleimide | GE Healthcare | PA23031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Cy5 maleimide | GE Healthcare | PA25031 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
Alexa Fluor 555 C2 Maleimide | Life Technologies | A-20346 | site-specific protein labeling via mutant unpaired cysteines |
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Microscope for fura-2-based calcium measurements | LEICA | DMI4000B | |
Microscope for (single molecule) FRET measurements | LEICA/ZEISS/NIKON/OLYMPUS | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | |
planar supported lipid bilayers | for details please refer to parallel JoVE contribution by Axmann et al. | ||
RPMI 1640, with L-Glutamine | Life Technologies | 11554416 | T-cell media |
non-essential amino acid 100X | Hyclone | SH30238.01 | T-cell media supplement |
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Origin (analysis program) | OrigenLab | http://www.originlab.com/ | non-linear fitting of two parameters (tauoff, [ntlag]) |