Summary

Analisi di<em> Yersinia enterocolitica</em> Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions

Published: October 13, 2015
doi:

Summary

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Abstract

Molti batteri gram-negativi, tra cui patogeno Yersinia spp. Impiegano tipo III sistemi di secrezione di traslocare le proteine ​​effettrici all'interno delle cellule bersaglio eucariotiche. All'interno della cellula ospite proteine ​​effettrici manipolare funzioni cellulari a beneficio dei batteri. Per meglio comprendere il controllo di tipo III secrezione durante l'interazione cellula ospite, dosaggi precisi e sensibile per misurare la traslocazione sono obbligatori. Abbiamo qui descriviamo l'applicazione di un saggio basato sulla fusione di un frammento di proteina effettore Yersinia enterocolitica (Yersinia proteina esterna; YopE). Con TEM-1 beta-lattamasi di analisi quantitativa di traslocazione Il test si basa sulla scissione di una cella permeante FRET dye (CCF4 / AM) da traslocata fusione di beta-lattamasi. Dopo la scissione del nucleo cefalosporine CCF4 dalla beta-lattamasi, FRET da cumarina a fluoresceina viene interrotto e l'eccitazione della porzione cumarina porta a blu emissione di fluorescenza.Differenti applicazioni di questo metodo sono stati descritti in letteratura evidenziando la sua versatilità. Il metodo consente di analizzare traslocazione in vitro e in vivo anche, ad esempio, in un modello di topo. Rilevazione dei segnali di fluorescenza può essere eseguita utilizzando lettori di piastre, analisi FACS o microscopia a fluorescenza. Nella configurazione descritta qui, in vitro traslocazione di fusioni effettrici in cellule HeLa da diversi mutanti Yersinia è monitorato mediante microscopia a scansione laser. Registrazione conversione intracellulare del reporter FRET dalla beta-lattamasi effettori fusione in tempo reale fornisce risultati quantitativi affidabili. Siamo qui Mostriamo dati esemplificativi, dimostrando una maggiore traslocazione da un Y. enterocolitica YopE mutante rispetto al ceppo selvatico.

Introduction

III sistemi di secrezione di tipo sono macchine proteina-export specializzata utilizzati da diversi generi di batteri gram-negativi per fornire direttamente le proteine ​​effettrici batteri codificate all'interno delle cellule bersaglio eucariotiche. Mentre il meccanismo secretorio stessa è altamente conservata, insiemi specializzati di proteine ​​effettrici sono evoluti tra le diverse specie batteriche per manipolare percorsi di segnalazione cellulare e facilitare specifiche strategie di virulenza batterica 1. In caso di Yersinia, fino a sette proteine ​​effettrici, i cosiddetti (proteine ​​esterne Yersinia) YOPS, sono traslocato al contatto della cellula ospite e agire insieme per sovvertire le risposte delle cellule immunitarie come la fagocitosi e la produzione di citochine, vale a dire, per permettere la sopravvivenza extracellulare dei batteri 2-4. Il processo di traslocazione è strettamente controllata in diverse fasi 5. E 'stabilito che l'attivazione primaria del T3SS è innescata dal suo contatto con il ce bersaglioll 6. Tuttavia, il meccanismo preciso di questa iniziazione deve ancora essere chiarito. In Yersinia un secondo livello di cosiddetta messa a punto di traslocazione si ottiene up- o down-regolare l'attività delle proteine ​​cellulari Rho GTP-binding Rac1 o RhoA. L'attivazione di Rac1 ad esempio invasina o citotossico necrotizzante fattore Y (CNF-Y) porta ad un aumento traslocazione 7-9, mentre la funzione del GAP traslocato YopE (GTPasi attivando proteina) down-regola l'attività Rac1 e diminuisce di conseguenza traslocazione da un tipo di feedback negativo Meccanismo di 10,11.

Metodi validi e precisi sono il presupposto per indagare come traslocazione è regolata durante l'interazione cellula ospite Yersinia. Molti sistemi differenti sono stati utilizzati per questo scopo, ciascuno con vantaggi e svantaggi specifici. Alcuni approcci si basano su lisi delle cellule infette, ma non i batteri da diversi detergenti seguita da western blot. The svantaggio comune di questi metodi è che la lisi batterica minore ma potenzialmente inevitabile contamina il lisato cellulare con batteri associati proteine ​​effettrici. Tuttavia, il trattamento di cellule con proteinasi K per degradare proteine ​​effettrici extracellulari e successivo utilizzo di digitonina per lisi selettiva delle cellule eucariotiche sono state proposte per minimizzare questo problema 12. È importante sottolineare che questi test cruciale dipendono anticorpi anti-effector alta qualità, che non sono per lo più disponibili in commercio. I tentativi di utilizzare fusioni traduzionali delle proteine ​​effettrici e proteine ​​fluorescenti come la GFP per monitorare traslocazione non hanno avuto successo probabilmente a causa della struttura terziaria delle proteine ​​globulari fluorescenti e l'incapacità dell'apparato di secrezione a svolgersi prima secrezione 13. Tuttavia, diverse etichette giornalista diversi, come il cya (calmodulina-dipendente ciclasi) dominio del tossina della pertosse Bordetella cyclolysin 14 o Flashtag sono stati utilizzati con successo per analizzare traslocazione. Nel primo saggio di attività enzimatica di cya viene utilizzato per amplificare il segnale della proteina di fusione intracellulare, mentre il tag Flash, un tag brevissimo tetracysteine ​​(4Cys) motivo, permette per l'etichettatura con il colorante Flash biarsenical senza disturbare il processo della secrezione 15.

L'approccio applicato qui è stato riportato per la prima volta da Charpentier et al. E si basa sulla conversione intracellulare del Förster Resonance Energy Transfer (FRET) dye CCF4 da traslocati effettore TEM-1 beta-lattamasi fusioni 16 (Figura 1A). CCF4 / AM è un composto cellulare permeanti in cui un derivato cumarina (donatore) e un residuo fluoresceina (accettore) sono collegati da un nucleo cefalosporina. All'entrata passivo nella cellula eucariotica, il non fluorescente esterificati composto CCF4 / AM viene elaborato dalle esterasi cellulari per il CCF4 carica e fluorescente e quindi intrappolatoall'interno della cellula. Eccitazione della porzione cumarina a 405 nm risultati in FRET alla frazione fluoresceina, che emette un segnale di fluorescenza verde a 530 nm. Dopo la scissione del nucleo cefalosporina dal FRET beta-lattamasi è interrotto e l'eccitazione della porzione cumarina porta a blu fluorescenza at460 nm. Differenti applicazioni di questo metodo sono stati descritti in letteratura evidenziando la sua versatilità. Il metodo consente di analizzare traslocazione in vitro e in vivo anche, ad esempio, la tecnica è stata utilizzata in un modello di infezione mouse per individuare le popolazioni leucocitarie mirati per traslocazione in vivo 17-19. Lettura dei segnali può essere condotta utilizzando lettori di piastre, FACS o microscopia a fluorescenza. Da notare, il metodo prevede anche la possibilità di monitorare traslocazione in tempo reale mediante microscopia live-cellulare durante il processo di infezione 20,21. Qui microscopia a scansione laser a fluorescenza è stato applicato per readout di segnali di fluorescenza in quanto fornisce massima sensibilità e precisione. In particolare, la capacità di regolare la finestra di emissione con precisione nanometrica in combinazione con rivelatori ad alta sensibili facilita ottimizzato rivelazione a fluorescenza e minimizzato cross-talk. Inoltre questa configurazione microscopia può essere adattato per il monitoraggio in tempo reale di traslocazione e potenzialmente consente per l'analisi simultanea di interazione ospite-patogeno a livello cellulare.

In questo studio i tassi di traslocazione di un Y. enterocolitica ceppo selvatico e una delezione mutante YopE esibendo un fenotipo hypertranslocator 10,11 sono stati analizzati in modo esemplare.

Protocol

1. picco di emissione e Cross-talk Determinazione (vedi anche figura 2) Al fine di determinare i picchi di emissione e la quantità di cross-talk tra il donatore (cumarina derivato V450) e accettore (fluoresceina) coloranti, eseguire scansioni spettrali di cellule marcate con entrambi i fluorofori individuali a 405 nm di eccitazione. Determinare un bandwidth 10 nm entro il picco di ogni colorante che verrà utilizzato per i canali donatore e accettore (455-465 nm qui e 525-535 nm). Tracciare l'i…

Representative Results

Per dimostrare la capacità del metodo descritto per analizzare quantitativamente effettrici traslocazione in cellule bersaglio, sono stati studiati due ceppi Yersinia con differenti cinetiche traslocazione: Y. enterocolitica ceppo selvatico WA-314 (sierogruppo O8, l'ospitare il plasmide di virulenza pYVO8 22) e la sua derivata WA-314ΔYopE (WA-314 ospitare pYVO8ΔYopE 23). Lavoro precedente ha mostrato che Y. mutanti enterocolitica privi funzionale mostra Yo…

Discussion

Siamo qui applicato con successo un saggio basato TEM-1 beta-lattamasi giornalista per l'analisi quantitativa dei effettori traslocazione di Y. enterocolitica. Molte diverse varianti di questa tecnica sensibile, specifico e relativamente semplice sono state descritte in letteratura. In questo studio microscopia a scansione laser è stato condotto per il rilevamento più sensibile e preciso dei segnali di fluorescenza. Specificamente la correzione per diafonia tra i coloranti donatore e accettore e …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Dr. Antonio Virgilio Failla for providing the FRET acquisition quantification algorithm and Erwin Bohn for providing the pMK-bla and pMK-ova constructs.

Materials

LB-Agar Roth X969.2
LB-Medium Roth X968.2
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8662-500ML
96-well plate (black, clear bottom) Greiner Bio One 655087
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Gibco/Life Technologies 31966-047
Probenecid Sigma-Aldrich P8761-25G
LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM Life Technologies K1095
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate Sigma-Aldrich L4895 Used for peak emission and cross-talk determination
V450 Rat anti-Mouse CD8a BD Bioscience 560469 Used for peak emission and cross-talk determination
Immersol W immersion oil  Zeiss 444969-0000-000 Refractive index = 1.3339 @ 23 °C
TCS SP5 II confocal laser scanning microscope Leica microsystems 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20x HC PL APO CS IMM/CORR, 405nm diode laser 50mW
Imaris 7.6 software Bitplane Plugins included ImarisXT and MeasurementPro
MatLab compiler runtime MathWorks
Prism 5 GraphPad software

References

  1. Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
  2. Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
  3. Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia’s stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
  4. Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
  5. Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
  6. Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
  7. Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
  8. Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
  9. Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
  10. Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
  11. Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
  12. Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
  13. Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
  14. Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
  15. Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
  16. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
  17. Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
  18. Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
  19. Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
  20. Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
  21. Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
  22. Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
  23. Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).

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Wolters, M., Zobiak, B., Nauth, T., Aepfelbacher, M. Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions. J. Vis. Exp. (104), e53115, doi:10.3791/53115 (2015).

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