Introduction
Type I og III interferoner (IFN) er kritiske i immunresponset til vira og andre patogene stimuli og til stede i alle hvirveldyr 1. Immune og ikke-immune celler udtrykker og udskiller, samt reagere på, IFN 2. Medfødte immunsystem sensorer, såsom toll-lignende receptorer (TLR), STING og RIG-I, inducere type I og III IFN ekspression ved detektion af patogen forbundet molekylære mønstre (Pamp) 3,4. Hos mennesker, type I IFN omfatter IFN-β, -ω, -κ og 12 undertyper af IFN-α og binder til IFNAR1 / IFNAR2 receptor-komplekset 2,5. Type III IFN omfatter IFN-λ1, -λ2 og -λ3 og binder til IL10RB / IL28RA receptorkomplekset 2. Klassisk, type I og III IFN binder til deres respektive receptorkomplekser som derefter rekrutterer STAT1 / STAT2 heterodimerer og initiere transskription af interferon stimulerede gener (ISG) 6. ISG er involveret i en bred vifte af funktioner, fra antiviral og antiproliferativ aktivitet til aktivering af svaret 7 adaptive immunrespons.
De mange mekanismer patogener har udviklet til at omgå, undergrave og kapre elementer i IFN signalering pathway vise betydningen af IFN i immunresponset medfødte 8. For eksempel vaccinia virus udtrykker en attrap receptor med IFNAR1 homologi der sekvestrerer type I IFN 9, mens en Yaba-lignende sygdom virus udskiller et glycoprotein, der inhiberer type I og III IFN-proteiner 10. Ud over deres rolle i værtsforsvar er IFN også impliceret i cancer overvågning og en række af auto-inflammatoriske sygdomme: silencing af IFN ekspression i brystcancerceller begrænser immunosurveillance 11 overproduktion af IFN-α er en mekanisme i udviklingen af systemisk lupus erythematosus 12 og vildfaren aktivering af STING fører til systemisk inflammation forårsaget af store mængder af IFN i STING-associeret vaskulopati13. Terapeutisk IFN anvendes til behandling af multipel sklerose 14, kroniske virusinfektioner såsom HBV 15 og HCV 16,17, og cancere, såsom hårcelleleukæmi 18 og kronisk myeloid leukæmi 19. Spørgsmål om relevansen af IFN i en bestemt fysiologisk proces kontinuerligt afslører den allestedsnærværende karakter af denne cytokin familie.
Type I IFN, især IFN-α-undertyper, der ofte betragtes som en enhed 20-23, snarere end som en gruppe af nært beslægtede, men forskellige, proteiner. Eksistensen og persistens af multiple IFN arter herunder IFN-α-undertyper hele hvirveldyr evolution 24 antyder, at i det mindste en delmængde af disse undertyper har specifikke eller unikke funktioner. Det er muligt, at der definerer mønstre af IFN ekspression vil dechifrere og hjælpe karakterisere de specifikke funktioner af en eller flere af de undertyper 17. Udfordringen i at studere than type I og III IFN subtyper er baseret på deres fælles sekvensidentitet: tolv IFN-α undertyper dele> 50% 25 og IFN-λ undertyper deler 81-96% 26 af deres aminosyresekvenser. I den beskrevne QRT-PCR assay molekylærbeacon (MB) og låst nukleinsyre (LNA) fluorescerende prober diskriminere enkelt forskelle basepar mellem de meget lignende IFN undertype sekvenser og tillade karakterisering af IFN ekspression signatur. Analysen er 384 brønde format indeholder både kvantitative (protokollatet standarder) og semi-kvantitative (housekeeping-gener (HKG)) foranstaltninger, der giver mulighed for analyse af udskrift nummer og ΔCq hhv. Batch samling, lettes ved automatiseret multikanals pipettering, og langtidsopbevaring, muligt ved tørring af primer / probe (Pr / Pb) fastsættes på pladerne, forbedre reproducerbarheden, nytteværdi, og praktiske analysen.
Denne protokol beskriver processentil fremstilling af 384-brønds QRT-PCR assay plader (figur 1) med op til sytten forskellige Pr / Pb sæt rettet humane IFN subtyper (tabel 1). Pr / Pb indstille arbejdslager source plader (figur 2) anvendes til at fremstille multiple 384-brønds assayplader i en proces, der kan automatiseres ved hjælp af en robot multikanalpipette. Mens oprindelige fokus var på at skabe en protokol til at studere human IFN udtryk underskrifter er denne metode blevet anvendt på makakaber så godt. Selvom plade layout er lidt anderledes og Pr / Pb sæt (tabel 2) er forskellige, den samlede forberedelse metode til at skabe de menneskelige og rhesus plader er identiske. Med minimale ændringer af protokollen, kunne den metode udføres for at give mulighed for udvikling af assays til at studere andre grupper af nært beslægtede gener.
Se figur 1 og 2 nedenfor
Se tabel 1 og 2 Below
Protocol
1. Fremstilling af Standard seriefortyndinger (figur 3A)
BEMÆRK: Serial fortyndingsrække af lineariserede plasmider indeholdende sekvenserne er omfattet af en Pr / Pb sæt anvendes som kvantitative standarder for QRT-PCR assay. Hver standard seriel fortynding sæt til IFN-undertyper indeholder nok volumen til at køre 90 assayplader. De fire punkter i standard fortyndingskurve anvendes til analysen er udvalgt til at dække Ct-værdier fra en række 20-32 (tabel 3).
- Thaw, vortex, og kortvarigt centrifugeres standard (50 pM) og laksesperm DNA (ssDNA, 10 mg / ml) stamopløsninger.
- Forbered ssDNA'et / vand mix for de 17 standardfortynding sæt ved at blande 51 pi ssDNA med 20,3 ml vand.
- Mærk en 8-rør PCR strip for et standard fortynding sæt.
BEMÆRK: Fremstilling af standardopløsninger af serielle fortyndinger fra stamopløsninger vil tage 2-3 timer. - Dispenser 190 pi af ssDNA'et / vand blanding til fFØRSTE rør i striben og 180 pi af ssDNA / vand blanding til de fem resterende rør.
- Udfør fortyndet 1:20 ved at overføre 10 pi fra 50 pM standard lager til røret med 190 pi af ssDNA / vand, blandes; vortex og hurtigt centrifugeres PCR strip.
- Udfør en 1:10 fortynding ved at overføre 20 pi fra den senest fortyndet rør til det næste rør i serien; vortex og hurtigt centrifugeres PCR strip.
- Gentag trin 1.6 indtil den sidste rør i fortyndingsrække har modtaget standard.
- Gentag trin 1,3-1,7 for hver standard.
Se tabel 3 nedenfor
2. Fremstilling af Primer / Probe (Pr / Pb) og nr Skabelon Kontrol (NTC) Working Stock Mixes (figur 3B)
BEMÆRK: Hver 1,7 ml Pr / Pb sæt arbejdslager og 128,6 pi Ingen Template Kontrol (NTC), der arbejder lager mix vil gøre 30 assayplader.
- Forbered arbejdslager blander Pr / Pb indstillet.
IKKEE: Fremstilling af Pr / Pb sæt og NTC arbejdslager blander fra stamopløsninger vil tage 2-3 timer.- Opslem primere og prober på 100 um med ultra-rent vand til fremstilling af stamopløsninger.
- Mærk op til sytten 2 ml rør; én for hver Pr / Pb sæt inkluderet i assayet.
- Thaw, vortex, og kortvarigt centrifugeres primerne (100 um) prober (100 um) og ssDNA (10 mg / ml) stamopløsninger.
- Tilsæt 2 pi ssDNA til hver rør ved hjælp af 12,5 pi elektronisk multikanalpipette. Tilsæt passende forward primer, revers primer og probe til hver Pr / Pb indstille arbejdslager rør. Se tabel 1 for de Pr / Pb sæt rettet human IFN-undertyper og tabel 2 for rhesus makak Pr / Pb sæt. Tilsættes vand, til mængden af hver Pr / Pb sæt arbejdslager rør til 200 pi.
BEMÆRK: Mængden af primere, probe og vand for at tilføje afhænger af den krævede endelige reaktion koncentration af et Pr / Pbindstillet.
- Forbered NTC arbejdslager blandinger.
- Label to 5-rør PCR strips for NTC arbejder bestandene blander.
- Overfør 14,3 pi af hver Pr / Pb indstillet til det korrekte NTC arbejdslager mix rør. Se tabel 4 for Pr / Pb sæt kombinationer for NTC brønde. Tilsæt vand til hver af de NTC arbejdslager blander at bringe det endelige volumen til 128,6 pi.
- Vortex kortvarigt centrifuge, og placere rørene i mørke på is eller ved -20 ° C til langtidsopbevaring.
Se tabel 4 nedenfor
- Fortynd Pr / Pb sat arbejder bestande.
- Efter fjernelsen af en portion af de Pr / Pb sæt kræves af NTC arbejdslager blandinger, tilsættes 1,5 ml vand til at bringe det endelige volumen af hver Pr / Pb sæt arbejdslager rør til 1,7 ml.
- Vortex kortvarigt centrifuge, og placere rørene i mørke på is eller ved -20 ° C i længere opbevaring sigt.
- Forbered en 96-brønds kilde plade af Pr / Pb sæt og NTC blandinger til alikvotere til 384-godt assayplader.
BEMÆRK: Forberedelse af kilden pladen fra Pr / Pb arbejde lager blandinger vil tage mindre end 1 time. Hver 96-brønds kilde plade er nok til at gøre seks 384-brønds assay plader (figur 3C).- Vortex og kortvarigt centrifugeres Pr / Pb sæt arbejder aktier og NTC arbejdslager blandinger.
- Placer en ny 96-brønds plade i en afkølet 96-brønds køleblokken og udpege brøndene for hver Pr / Pb sæt eller NTC blande brøndene modtager (se figur 2).
- Tilsæt vand til 96-brønds plade under anvendelse af en 250 pi elektronisk multikanalpipette: Dispenser 66 pi vand til hvert Pr / Pb sat godt (undtagen 4 brønde til Target 17). Dispenser 82,5 pi vand til 4 Target 17 brønde. Dispenser 27,5 pi vand til hver NTC bland godt. Tilføj den rigtige Pr / Pb indstille arbejdslager til de udpegede brønde i 96-brønds plade: Dispenser 54 pi af den korrekte Pr / Pb indstille arbejdslager til de udpegede Pr / Pb sæt brønde (undtagen 4 brønde til Target 17). Dispenser 67,5 pi af Target 17 Pr / Pb sat arbejder lager til de udpegede Mål 17 Pr / Pb sæt brønde. Tilføj 22,5 pi det korrekte NTC arbejdslager mix til de udpegede brønde.
- Seal 96-brønds plade med en klæbende plade forsegling og centrifugeres i 1 minut ved 700 xg for at sikre, at indholdet er i bunden af brøndene.
- Placer 96-brønds plade i vortex mixer under anvendelse af en 96-brønds plade adapter og blandes i 1 minut ved 1000 rpm. Centrifuger plade med 96 brønde i 5 minutter ved 700 x g.
- Opbevar 96-brønds kilde plade i mørke ved 4 ° C, hvis anvendelse i den samme dag, ellers opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse.
- Forbered 384-brønds assayplader ved tilsætning af Pr / Pb sæt på det automatiserede multikanalpipette.
BEMÆRK: Fremstilling af seks assayplader fra 96-brønds kilde plade vil tage 3-4 timer.- Forud for plader, præ-chill afkøling reden til 4 ° C og forvarme pladen fordamper til 125 ° C og den nederste varmeblok til 80 ° C med luftstrøm blæser 20-25 liter pr min (LPM).
- Tænd for automatiserede multikanalpipette og åbn protokol for at gøre IFN assayplader ved at dobbeltklikke på ikonet software.
- For at indstille platformen, placere en helt fuld pipettespids boksen platform position 1, den 96-godt kilde plade i position 4, og en ny 384 brønde i position 6. Begynd kørslen ved at trykke på play-knappen.
BEMÆRK: Ved afslutningen af en kørsel, godt hver indeholder 5 pi Pr / Pb mix.
BEMÆRK: Det endelige beløb på ssDNA tilsat pr brønd i 384-godt assayplade er 0,025 ug. - Bank forsigtigt på 384-godt assaypladen på en flad overflade for at sikre væsker er i bunden af brøndene og anvende et klæbemiddelplade forsegling.
- Centrifugeres pladen i 1 min ved 700 x g. Fjern den klæbende plade forsegling placere 384-brønds assayplade i pladen tørretumbler og placere 384-brønds manifold direkte over brøndene.
- Når 384-godt assayplade indhold tør, anvende en ny selvklæbende plade sæl, wrap i folie, label, og opbevar i mørke ved 4 ° C indtil brug.
BEMÆRK: Plader kan lagres ved 4 ° C i mindst 6 måneder. - Gentag trin 3.2.3-3.2.6 indtil 6 x 384-brønds assayplader fremstilles eller væsken i 96-brønds kilde plade er opbrugt.
- Sluk for køling reden, lukke softwaren, og sluk for automatiserede multikanalpipette. Sluk pladen tørretumbler.
4. Læsning og Kørsel en 384-godt assayplade
- Forbered to husholdning gen (HKG) godt blandinger, der består af Pr / Pb sæt til en HKG, ssDNA, PCR Master mix, og vand, der skal føjes til en tørret 384 brønde assayplade (
- Mærk et 1,5 ml rør for hver HKG mix.
- Fortynd 2 pi ssDNA (10 mg / ml) med 84,9 pi vand. Tilsæt 2 pi af den fortyndede ssDNA, 11,8 pi vand, 23 pi Master mix, og 9,2 pi af den korrekte 20x HKG Pr / Pr sat til hvert rør, vortex, og kort centrifuge.
- Brug glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) og ubiquitin C (UBC) som HKG for human assay (se Materialer tabellen). Brug GAPDH og 18S ribosomalt RNA som HKG for rhesus assay.
BEMÆRK: HKG anvendes til at udføre analysen er fleksible og bør afspejle de gener, der passer til den celletype, der testes GAPDH, UBC og 18S er eksempler på almindeligt anvendte HKG;. andre HKG kan være mere passende.
- Prøven og Posi- Forberedve styre godt mix, som består af prøven eller positiv kontrol cDNA, master mix og vand, der skal føjes til en tørret 384 brønde assayplade. Forbered prøven og den positive kontrol blandinger i tilstrækkelig mængde til at dispensere til 21 brønde (figur 3D).
- Forud for cDNA syntese Følg producentens anvisninger for at forberede RNA-prøver med et DNase fordøjelsen skridt.
- Forberede prøverne og den positive kontrol i forvejen fra cDNA-syntese på mindst 500 ng RNA efterfulgt af behandling med RNase H (slutvolumen på 24 pi for hver prøve) ved at følge producentens instruktioner. Opbevar den forberedte cDNA ved -20 ° C indtil anvendelse. Thaw, vortex, og kortvarigt centrifugeres prøven cDNA.
- Tilføj 78,8 pi mester mix og 54.8 pi vand til hver 24 pi prøve og positiv kontrol rør.
- Vortex og kort centrifugere rørene.
- Forbered standarderne og NTC godt blander, conbestående af Master mix og vand, der skal sættes til en tørret 384-brønds assayplade (figur 3D). For standarderne godt blandes, tilsættes 165 pi vand til 275 pi masterblanding i et 1,5 ml rør. For NTC godt blandes, tilsættes 52,5 pi vand til 52,5 pi masterblanding i et 1,5 ml rør. Vortex og kort centrifugere rørene.
- Forbered en tørret 384-brønds assayplade til lastning af blandingerne og prøver.
- Fjern en tørret 384-brønds assayplade fra 4 ° C og centrifugeres i 1 min ved 700 x g.
- Pladen anbringes på en afkølet 384-brønds køleblok, fjerne den klæbende plade forsegling og skitsere brøndene i pladen til at udpege, hvor de forskellige blandinger og prøver pipetteres (figur 1).
- Læg 384-godt assayplade med standard godt mix, standarder, NTC godt mix, prøver, positiv kontrol og HKG mix (Figur 3E). Vortex og kort centrifuge alle løsninger, før udlevering til pladen.
- Dispenser 6 pi af standarderne godt mix til hver standard godt med 30 pi elektroniske multikanalpipette. Dispenser 1,5 pi af den korrekte standard seriel fortynding til den udpegede godt med 12,5 pi elektronisk multikanalpipette.
- Dispenser 7,5 pi NTC godt mix til hver NTC godt med 30 pi elektroniske multikanalpipette. Dispenser 7,5 pi af prøven til de udpegede brønde med 30 pi elektroniske multikanalpipette. Dispenser 2,5 pi af HKG Pr / Pb blander til de udpegede brønde med 12,5 pi elektroniske multikanalpipette.
- Fyld eventuelle tomme brønde med 7,5 pi af sidesten blanding vand og master mix med 30 pi elektroniske multikanalpipette; 7,5 pi vand alene vil også arbejde.
- Forsegl 384-brønds assayplade med optisk selvklæbende film og centrifugeres i 1 min ved 700 x g. Vortex forseglede 384 brønde i vortex mixer i 2 minutter ved 2.600 rpmog centrifugeres i 5 minutter ved 700 x g.
- Placer forseglede 384 brønde assaypladen i QRT-PCR-maskine, skal du åbne skabelonen for analysen layout og starte kørslen.
BEMÆRK: Resultaterne kan eksporteres som et regneark eller som en tekstfil til analyse. - Brug følgende optimale thermocycler reaktionsbetingelser til assayet: i) 50 ° C i 2 minutter, ii) 95 ° C i 10 minutter, iii) 95 ° C i 25 s, iv) 59 ° C i 1 min. Gentag trin III og IV i 40 cykler.
- Eksporter de rå data fra QRT-PCR-platform i et regneark software. Plot hver 4 point standard indstillet som en standardkurve at observere linearitet. Udfør analyse ved at beregne ΔCq eller kopi nummer baseret på fire point standardkurver 27.
Se figur 3 nedenfor
Representative Results
The qRT-PCR assay beskrevet kan gennemføres for at analysere ekspressionsmønstre af type I og III IFN i en række celletyper og sammenhænge. For eksempel blev human type I og III IFN ekspressionsvektorer signaturer analyseret i perifere mononukleære blodceller (PBMC) fra 6 donorer stimuleret med TLR ligander; poly I: C (25 ug / ml), LPS (10 ng / ml) imiquimod (10 uM) og CpG-oligonukleotider (1 uM) (figur 4). Data blev analyseret under anvendelse af et regneark applikationssoftware og præsenteres som radardiagrammer med IFN-α-undertyper arrangeret med uret ifølge det fylogenetiske træ deres proteinsekvens 27. De radar diagrammer af humane IFN udtryk præsenteres i en log skala beregnes ved hjælp af to forskellige analysemetoder, indarbejdet i analysen design: absolut Cq værdi normaliseret til HKG (ΔCq), og kopier antal skabelon per mikrogram (ug) af total RNA . Kopital værdier beregnes ud fra resultaterne o fa udskrift standard kurve. Dataene viser, at humant IFN udtryk signaturer fremkaldt af TLR agonister er ligand specifik.
Se figur 4 nedenfor
Som vist for den humane IFN udtryk signaturer, udtryk underskrifter type I og III IFN i makakaber var også TLR ligand specifik. PBMC fra 3 donorer blev stimuleret med poly I: C (50 ug / ml), LPS (10 ug / ml), og imiquimod (10 ug / ml) i 3 timer (figur 5). IFN-undertype-ekspression i ikke-stimulerede celler ved baseline var lav. Et begrænset antal af IFN-undertyper blev udtrykt som reaktion på LPS og poly I: C. I modsætning hertil IFN ekspression i respons på imiquimod var høj og subtype ekspression var bred. Ekspression af IFN-β og IFN-λ1 blev styrket ved alle tre TLR agonister 28.
Se figur 5 nedenfor
altid ">
Figur 1:. Layoutet for en 384-godt assayplade med sytten Pr / Pb sæt Target nummer refererer til en Pr / Pb sæt. De fire point standard kurver (mørkegrå trekant) tilsættes til kolonne 1-5. De HKG Pr / Pb sæt (hvid baggrund) tilsættes til kolonne 6 og 7. De resterende kolonner, 8-24, er specifikke for en af de sytten Pr / Pb sæt. Prøver sættes til rækkerne AP fra kolonnerne 6-24 (sorte pile). De to brønde (O5, P5) i bunden af kolonne 5 får kun vand og master mix. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 2:. Layoutet for en 96-brønds kilde plade med sytten Pr / Pb sæt Target nummer refererer til en Pr / Pbindstillet. Sorte pile repræsenterer, når der tilføjes en Pr / Pb sæt til flere brønde. NTC blandinger tilsættes til de udpegede brønde (mørkegrå baggrund). De to brønde (F3, G3) med diagonale linjer er ubrugte. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3: Skematisk af konkrete skridt i QRT-PCR-assay-protokol AE diagram vælge dele af protokollen.. (A) Trin 1: Fremstilling af standard serielle fortyndinger. (B) Trin 2: Fremstilling af Pr / Pb og NTC arbejdslager blandinger. (C) Trin 3.1: Fremstilling af en 96-brønds arbejder lagre plade af PR / Pb sæt og NTC blandinger. (D) Trin 4,1-3: Fremstilling af blandingerne til at overføre de 384 brønde assayplade. (E) Step 4.5: Ilægning af 384 brønde assayplade. Diagrammer læses fra øverste venstre hjørne til nederste højre hjørne. Reagenser til interferon (IFN) assay opbevares ved -20 ° C og er angivet i den venstre søjle; linjer særskilte handlinger i protokollen. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4: den humane IFN ekspression signatur i perifere mononukleære blodceller (PBMC) adskiller reaktion på TLR ligander anvendes til stimulation PBMC blev stimuleret med TLR ligander og RNA blev høstet til QRT-PCR-analyse.. De geometriske middelværdier af peak reaktioner poly I: C (25 ug / ml) i 8 timer (røde firkanter), LPS (10 ng / ml) ved 4 timer (grønne trekanter), imiquimod (10 uM) ved 16 timer ( lilla diamanter), CpG (1 uM) ved16 timer (sorte cirkler) og ustimulerede kontrol ved 16 timer (blå cirkler) fra 6 donorer er vist i log 10 omfang som en funktion af ekspression af HKG UBC ΔCq (venstre) eller som kopiantal pr ug RNA (højre) . IFN-α-undertyper er ordnet ifølge den fylogenetiske plot af aminosyresekvens lighed. Dette tal blev oprindeligt udgivet i Immunologi og Cell Biology 27.
Figur 5:. Rhesus macaque IFN ekspression signatur i perifere mononukleære blodceller (PBMC) adskiller reaktion på TLR ligander anvendes til stimulation PBMC fra tre makakaber (udpeget af pladsen, diamant, og trekant) blev isoleret fra helblod og stimuleret med lipopolysaccharid (LPS) (10 ug / ml), poly I: C (50 ug / ml) eller imiquimod (10 ug / ml). Celler blev høstet ved 0 timer (open former) eller efter 3 timer af TLR stimulation (lukkede figurer) til måling af IFN-ekspression. Transkriptniveauer af type I, II og III IFN vises i log 10 omfang som en funktion af ekspression af HKG GAPDH ΔCq (venstre) eller som kopiantal / ug RNA (højre). Dette tal blev oprindeligt offentliggjort i Journal of Interferon og Cytokine Research 28.
Tabel 1:. Humant IFN primer / probe sæt sekvenser og reaktion information Klik her for at se en større version af denne tabel.
Tabel 2:. Rhesus makak IFN primer / probe sæt sekvenser og reaktion information Klik her for at se en større version af denne tabel.
| Plasmidkoncentration (FM) | ||||
| A | B | C | D | |
| IFN-α1 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0,025 |
| IFN-α2 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0,025 |
| IFN-α4 | 2500 | 250 | 25 | 2.5 |
| IFN-α5 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0,025 |
| IFN-α6 | 250 | 25 | 2.5 | 0.25 |
| IFN-α7 | 250 | 25 | 2.5 | 0.25 |
| IFN-α8 | 250 | 25 | 2.5 | 0.25 |
| IFN-α10 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0,025 |
| IFN-α14 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0,025 |
| IFN-α16 | 250 | 25 | 2.5 | 0.25 |
| IFN-α17 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0,025 |
| IFN-α21 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0,025 |
| IFN-λ1 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0,025 |
| IFN-λ2 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0,025 |
| IFN-λ3 | 250 | 25 | 2.5 | 0.25 |
| IFN-β | 25 | 2.5 | 0.25 | 0,025 |
| IFN-ω | 250 | 25 | 2.5 | 0.25 |
Tabel 3: Standard fortynding sæt koncentration oplysninger.
| IFN Pr / Pb Sets tilføjet | Vand volumen tilsat (ml) | |
| NTC 1 | IFN-β, -ω, -λ3 | 85,7 |
| NTC 2 | IFN-α1, -α5 | 100,0 |
| NTC 3 | IFN-α2 | 114,3 |
| NTC 4 | IFN-α4 | 114,3 |
| NTC 5 | IFN-α7 | 114,3 |
| NTC 6 | IFN-α6, -α8, -α10 | 85,7 |
| NTC 7 | IFN-α14, -α16 | 100,0 |
| NTC 8 | IFN-α17 | 114,3 |
| NTC 9 | IFN-α21, -λ1 | 100,0 |
| NTC 10 | IFN-λ2 | 114,3 |
Tabel 4: NTC arbejdslager blander information.
Discussion
Denne rapport beskriver design, serieproduktion, og en tilgang til analyse af et assay til måling af transskription af et sæt af meget lignende gener i et forskningslaboratorium indstilling. Den high-throughput QRT-PCR analyse rapporteres her måler IFN og - λ undertyper med høj specificitet. Denne metode indebærer to centrale aspekter, design af Pr / Pb-apparater, der diskriminerer mellem medlemmer af et homologt gen familie og udvikling af en produktionsplatform for oprettelse af pålidelige og sammenhængende 384-brønds assayplader præinstalleret med PR / PB sæt. De QRT-PCR-prober indarbejde en strukturel (MB) eller kemisk (LNA) tilgang til at øge deres specificitet 29. For to af primersæt i rhesus assay (tabel 2) blev amplifikationen-refraktære mutation (ARMS) inkorporeret i primersekvenserne for yderligere at forbedre specificiteten 30. Selv om det er generelt bedst til at målrette exon-exon junctions til enhance specificitet af en QRT-PCR-reaktion, var dette ikke muligt, fordi type I IFN generne mangler introns. Derfor vil genomisk DNA amplificeret i PCR-reaktionen, og skal nedbrydes ved DNase-behandling efter RNA-ekstraktion.
Målet region for PR / PB sæt var begrænset til de kodende regioner af det modne peptid for hver IFN. På grund af den høje sekvenslighed blandt IFN-α-undertyper, især den modne peptid region, var det undertiden nødvendigt at gå på kompromis følsomhed for at sikre specificitet. Dette var især tilfældet med IFN-α17, hvor det modne peptid transskript har kun fire unikke baser når sammenlignet med andre IFN-α-undertyper. Målretning IFN-α17 krævede primere, som binder de udskrifter af flere undertyper, der begrænser specificitet til sonden. Som følge heraf vil PCR-reaktionen amplificere andre undertyper end IFN-α17, hvorved der forbruges en væsentlig procentdel af PCR-reagenser og lowering amplituden af fluorescenssignalet fra den specifikke probe til IFN-α17. En yderligere udfordring i retning designe følsomme og specifikke Pr / Pb sæt til meget lignende gener, såsom IFN er den mulighed, at den kommenterede sekvenser i GenBank-databasen ikke kan være fuldstændig eller omfattende på tidspunktet for design. Igen var det en udfordring for IFN-α17, hvor nyligt kommenterede sekvenser ikke slutter perfekt med den version af sekvensen i databasen på tidspunktet for design. Derfor, når designe Pr / Pb sæt til gener, som ikke er intensivt undersøgt, er det klogt at regelmæssigt kontrollere den seneste kommenteret sekvens af et målgen. Endelig er det nødvendigt at sikre, at de Pr / Pb sæt ikke forstærke pseudogener som kan transskriberet men oversat ikke.
Efter at designe PR / PB sæt, er den næste udfordring at optimere PCR betingelser i sytten forskellige Pr / Pb sætter på en 384-brønds plade. Udskrift standarder er betydtigt i at teste specificiteten af en Pr / Pb sæt og bliver afgørende for harmonisering af qRT-PCR-betingelser for de mange forskellige PCR-reaktioner. Test en Pr / Pb sæt mod Transcript standarder fastlægger dens effektivitet og følsomhed; plasmider, der udtrykker meget lignende pseudogener kan være nødvendigt at sikre, at Pr / Pb indstillet selektivt måler transkription af funktionelt gen. Transcript standarder også en kvantitativ hjælp af analyse (antal transkripter) i tillæg til den semi-kvantitativ analyse i forhold til en husholdning gen (ΔCq).
Robotic multikanal pipettering fra en 96-brønds kilde plade i flere 384-brønds assayplader forbedrer præcision og konsistens af inter-plade resultater. Laks sperm DNA (ssDNA) anvendes som en bærer, der stabiliserer og bevarer Pr / Pb sæt til langtidsopbevaring, ligesom tørring af reagenser dispenseret i pladerne. Tørring pladerne formindsker også volumenet af reaktionennødvendige for reproducerbare resultater, hvilket igen bevarer værdifulde prøver og nedsætter brugen af dyre reagenser. Gennem disse trin, er partier af plader samles der giver præcision og konsistens i mere end seks måneder.
Efter forberedelse plade, kvalitetskontrol foranstaltninger er afgørende for at kontrollere sammenhængen i et parti af plader. Til dette formål er yderligere fire sæt af standarder køre på en tallerken. Den "5x standard" plade spor og skaber et datasæt, som en individuel plade standarder sammenlignes. Mens ti 10-fold fortyndinger af hver standard anvendes under assay design, pladshensyn kræver, at fire punkter anvendes til standardkurven på hver assayplade og for 5x standard plade. Derudover bør en positiv kontrol inkluderes på hver plade for at sikre gyldigheden af pladen.
Det tager typisk 3-4 timer til at forberede seks assayplader fra én Pr / Pb silde plade; det er muligt at fremstille tolv plader på en enkelt dag i et forskningslaboratorium. Da hver human IFN undertype assaypladen undersøger sytten Pr / Pb-apparater og kan rumme femten eksperimentelle prøver, en dag forsamlingsfrihed producerer en batch af plader med kapacitet til at generere op til 3.060 eksperimentelle datapunkter. Rådata fra QRT-PCR-platform, kan behandles og samles ved hjælp af programmering scripts i et regneark software til automatisk at udfylde en forhåndsudformede analyse skabelon. Denne metode minimerer hands-on indtastning af data, hvilket forhindrer kopiering fejl og tillader investigator til at fokusere på dataanalyse i stedet data forsamling. Som beskrevet her, kan denne high-throughput QRT-PCR assay anvendes til at måle ekspressionen af interferon-undertyper i humane eller rhesus macaque prøver og kan tilpasses til brug for andre arter eller homologt gen sæt. Fleksibiliteten af pladen layout tillader brugeren at ændre primer / probe indstiller at skræddersy generinteresse mod en bestemt celletype eller model system. Dette assay kan anvendes til at måle IFN ekspressionsvektorer signaturer i cellekulturmodeller studerer patogener eller i patientprøver i forbindelse med sygdomsmodeller at belyse signaleringsdata mekanismer involveret i immunrespons.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af CBER / FDA-NIAID / NIH Interagency aftalen Yi AI-6153-01, FDA / CBER murene midler, og FDA medicinske modforanstaltninger Initiative. TCT, MNB, VPM, LMS, og KDK blev støttet af en udnævnelse til forskning Deltagelse Program ved Center for Biologics Evaluation og Forskning administreres af Oak Ridge Institute for Science Education gennem en Interagency aftale mellem USA Departmen of Energy og USA Food and Drug Administration.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
| 12-channel Electronic Pipette, 5-250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
| 2.0 ml Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
| 8-channel Electronic Pipette, 15-1250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
| Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
| E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
| Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
| Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
| LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
| LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 30 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1,250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
| Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
| MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
| Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
| Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
| Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
| Rnase-Free 1.5 ml Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
| RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
| RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
| Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
| SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
| ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
| Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
| Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
| Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
| Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |
References
- Yan, N., Chen, Z. J.
- Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).
- Baum, A., Garcia-Sastre, A. Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates. Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).
- Kotenko, S. V., et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nature. 4, 69-77 (2003).
- Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics. 84, 331-345 (2004).
- Cheon, H., et al. IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage. The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).
- Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).
- Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses. Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).
- Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).
- Huang, J., et al. Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).
- Bidwell, B. N., et al. Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape. Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).
- Di Domizio, J., Cao, W. Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases. Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).
- Crow, Y. J., Casanova, J. L. STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy. The New England journal of medicine. , (2014).
- Bermel, R. A., Rudick, R. A. Interferon-beta treatment for multiple sclerosis. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).
- Kingham, J. G., et al. Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon. Gut. 19, 91-94 (1978).
- Heathcote, J., Main, J.
- Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection. Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).
- Castaigne, S., et al. Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia. Cancer. 57, 1681-1684 (1986).
- Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia. The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).
- Dai, C., et al. Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure. Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).
- Maeda, S., et al. Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line. The Journal of biological chemistry. , (2014).
- Xia, C. Q., et al. Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production. Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).
- Hervas-Stubbs, S., et al. Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming. Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).
- Manry, J., et al. Evolutionary genetic dissection of human interferons. The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).
- Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. Diversity and relatedness among the type I interferons. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).
- Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family. PloS one. 4, e4933 (2009).
- Hillyer, P., et al. Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent. Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).
- Schramm, L. M., et al. High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).
- Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid. Theranostics. 3, 395-408 (2013).
- Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).
