This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.
Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-α subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-λ2 and -λ3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.
Tip I ve III 'interferonlar (IFN) tüm omurgalıların 1 virüs ve diğer patojenik uyarıcılara, mevcut immün yanıt olarak büyük önem taşımaktadır. Bağışıklık ve olmayan bağışıklık hücreleri cevap için, IFN 2 yanı sıra, ifade ve salgılarlar. Gibi paralı-benzeri reseptörler (TLR), SOKMASI ve Rig-I gibi doğuştan gelen bağışıklık sensörler, patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMP) 3,4 tespiti üzerine tip I ve III IFN ifadesini neden. İnsanlarda, bir IFN tipi 2,5 kompleks IFNAR 1 / IFNAR2 reseptörü, IFN-β, -ω, -κ ve IFN-α 12 alt tipleri ve bağlama yer alır. Tip III, IFN, IFN-λ1, -λ2 ve -λ3 dahildir ve IL10RB / IL28RA reseptör kompleksi 2 bağlanır. Klasik, tip I ve III IFN ardından STAT1 / STAT2 heterodimerlerini işe ve interferon uyarılmış genlerin (ISG) 6 transkripsiyonunu başlatmak kendi reseptör kompleksleri bağlama. İSG, antiviral ve anti-dan, fonksiyonları çok çeşitli katılanAdaptif immün yanıtı 7 aktivasyonuna çoğalma etkinliği.
patojenler kaçmasına altüst ve IFN sinyal yolunun elemanları kaçırma geliştiğini çok sayıda mekanizma, doğuştan gelen bağışıklık tepkisi 8 IFN'nin önemini göstermektedir. Örneğin, aşı virüsü, bir Yaba-benzeri hastalığı virüsü I ve III IFN proteini 10 yazın önleyen bir glikoprotein salgılar ederken 9 IFN yazın tecrit IFNAR1 homoloji ile bir tuzak reseptörü ifade eder. Ev sahibi savunma rollerine ilave olarak, IFN aynı zamanda, kanser gözetim ve oto-enflamatuar hastalıkların bir dizi implike edilmiştir: göğüs kanseri hücrelerinin IFN ifade susturma immün 11 sınırlayan IFN-α aşırı üretimi sistemik gelişiminde bir mekanizmadır lupus eritematozus 12, ve SOKMASI ve hatalı aktivasyon STING ilişkili vaskülopatisi IFN aşırı miktarda neden sistemik inflamasyona yol açar13. Terapötik olarak IFN multipl skleroz 14 tedavi etmek için kullanılır, örneğin tüylü hücre lösemisi 18 ve kronik miyelojenik lösemi 19 gibi HBV 15 ve HCV 16,17 ve kanser gibi kronik viral enfeksiyonlar. Belirli bir fizyolojik süreç içinde IFN alaka ile ilgili sorular sürekli bu sitokin ailesinin her yerde doğasını ortaya koyuyor.
Özellikle IFN-α alt tipleri, genellikle bir varlık olarak 20-23 yerine bir yakından ilişkili grup, ancak farklı, proteinler olarak kabul edilir Ben IFN, yazın. Omurgalı evrim 24 boyunca varlığı ve IFN-α alt tipleri de dahil olmak üzere birden fazla IFN türlerine sürmesi, bu alt türlerin en azından bir alt kümesi, belirli veya benzersiz bir işleve sahip olduğunu göstermektedir. Bu, IFN ifade tanımlayan desen çözer ve alt tiplerinin 17 arasında bir veya daha fazla özel fonksiyonları karakterize etmeye yardımcı olması mümkündür. t okuyan meydanonların, paylaşılan bu sekans kimliğine dayalı olan I ve III, IFN alt tiplerini yazın: on iki IFN-α alt tipleri> 50% 25 paylaşan ve IFN-λ alt tipleri, amino asit dizileri arasında 81-96% 26 paylaşır. Tarif Mah-PCR deneyinde, moleküler işaret (MB) ve kilitli nükleik asit (LNA) floresan sondalar çok benzer IFN alt tipi dizileri arasında tek baz çifti farklılıkları ayırt ve IFN ifade imza karakterizasyonu için izin verir. Testi Yeni 384 kuyucuklu plak format sırasıyla transkript kopya sayısına ve ΔCq ile analiz için izin kantitatif (transkript standartları) ve yarı-kantitatif (temizlik genler (HKG)) önlemleri içerir. Astar / sonda (Pr / Pb) kurutulması ile mümkün otomatik çok kanallı pipetle ve uzun süreli depolama, kolaylaştırdı Toplu montaj, testin tekrarlanabilirliği, programı, ve pratiklik geliştirmek, plakalar üzerinde ayarlar.
Bu protokol işlemi tarif384 gözlü QRT-PCR testi plakaları insan IFN alt tiplerini (Tablo 1) hedefleme için on yedi farklı Pr / Pb setleri ile (Şekil 1) üretimi için. Pr / Pb hazır kaynak plakaları (Şekil 2), bir robot çok kanallı pipet kullanılarak, otomatik bir işlemde, birden çok 384 oyuklu deney plakaları hazırlamak için kullanılan olarak ayarlayın. Ilk odak insan IFN ifade imzaları çalışmak için bir protokol oluşturmaya ilişkin iken, bu yöntem, aynı zamanda, rhesus macaques uygulanmıştır. Levha düzenleri biraz farklıdır ve Pr / Pb setleri (Tablo 2) belirgin olmasına rağmen, insan ve resus plakalar oluşturmak için genel hazırlama yöntemi aynıdır. Protokolün en az modifikasyon ile, yöntem yakından ilişkili genlerin diğer grupları çalışma testlerin geliştirilmesi için izin vermek için yürütülebilir.
Bkz Şekil 1 ve 2 Aşağıda
Tablo 1 ve 2 Bel görow
Bu rapor, tasarım, toplu üretim ve bir araştırma laboratuar ortamında yüksek olarak benzer genlerin bir dizi transkripsiyonunu ölçmek için bir deney analizinin doğru bir yaklaşımı tarif eder. Burada bildirilen yüksek verimli QRT-PCR testi IFN ve ölçer – yüksek özgüllük ile λ alt tipleri. Bu yöntem iki temel yönlerini, bir homolog gen ailesinin üyeleri ve Pr / Pb setleri ile önceden yüklenmiş, güvenilir ve tutarlı 384 tahlil plakaları oluşturulması için bir üretim platformu gelişimi arasında ayrım Pr / Pb setleri tasarımı içerir. Mah-PCR probları kendi özgünlüklerini 29 artırılmasına yönelik yapısal (MB) veya kimyasal (LNA) yaklaşımı içermektedir. Rhesus tahlilinde (Tablo 2) astar setlerinin ikisi için, amplifikasyon refraktör mutasyon sistem (ARMS) daha fazla özgüllük, 30 geliştirmek için primer diziler dahil edilmiştir. Bu Enha için ekson-ekson bağlantı yerleri hedef, genel olarak en iyi ikentip I genler intronlan eksikliği IFN çünkü Mah-PCR reaksiyonunun nce özgüllüğü, bu mümkün değildi. Bu nedenle, genomik DNA, PCR reaksiyonunda amplifiye edilecek ve RNA ekstraksiyonu sonra DNase muamelesi ile bozulmuş olması gerekir.
Pr / Pb kümeleri için, hedef bölge, her bir IFN için olgun peptide ait kodlama bölgeleri ile sınırlandırılmıştır. IFN-α alt türlerine, özellikle olgun peptid bölgesi arasında yüksek dizi benzerliği nedeniyle, özgüllük sağlamak için duyarlılık uzlaşma bazen gerekli oldu. Bu özellikle diğer IFN-α alt tiplerine karşı karşılaştırıldığında olgun peptid transkript sadece dört benzersiz üsleri olan IFN-α17, böyleydi. Hedefleme, IFN-α17 sondasına özgüllük sınırlayan çok sayıda alt-tiplerinin transkript bağlanan primerler gerekmez. Bunun bir sonucu olarak, PCR reaksiyonu, böylece, PCR reaktifleri ve loweri önemli bir yüzdesini alıcı IFN-α17 başka alt tipi artıracaktırIFN-α17 için spesifik sonda floresan sinyalinin genliği ng. Böyle IFN gibi son derece benzer genler için duyarlı ve özgül Pr / Pb setleri tasarımı yönelik ek bir zorluk Gen bankasındaki açıklamalı dizileri tasarım sırasında tam veya kapsamlı olmayabilir olasılığıdır. Yine, bu yeni açıklamalı dizileri mükemmel tasarımı sırasında veritabanında dizisinin sürümü ile aynı hizaya etmeyen IFN-α17 için bir meydan okuma oldu. Pr tasarlarken Bu nedenle, / Pb yoğun çalışma yapılmamıştır genler için ayarlar, periyodik bir hedef genin son açıklamalı dizisini kontrol etmek akıllıca olacaktır. Son olarak, Pr / Pb setleri Kopyası çıkarılan ancak çevrilmeyen edilebilir pseudogenleri amplifiye emin olmak için gereklidir.
Pr / Pb setleri tasarladıktan sonra, bir sonraki zorluk yedi farklı Pr / Pb PCR koşulları optimize ediyor, bir 384-plaka üzerinde ayarlar. Transkript standartları impor olanBir Pr / Pb kümesi özgünlüğünü test ve çok sayıda farklı PCR reaksiyonlarının Mah-PCR koşulları uyumlaştırılması için gerekli hale de tant. Transkript standartlarına karşı Pr / Pb seti test verimliliği ve hassasiyetini kurar; yüksek oranda benzer pseudogenleri ifade plazmidleri Pr / Pb seçici olarak işlevsel bir genin transkripsiyonunu ölçer sağlamak için gerekli olabilir. transkript standartları da bir ev bakıcısı geni (ΔCq) yarı-nicel analiz nisbetle ek olarak, analiz, bir sayısal aracı (transkript sayısı) bulunur.
Birden fazla 384 oyuklu deney plakaları bir 96-çukurlu bir kaynak plaka Robotik çok kanallı pipet hassas ve inter-plak sonuçları tutarlılığını arttırır. Yapar plaka içine tevzi reaktif kurutma gibi somon sperm DNA (ssDNA), stabilize eder ve uzun süreli depolama için Pr / Pb setleri koruyan bir taşıyıcı madde olarak kullanılır. Plakaları Kurutma de reaksiyon hacmi azaltırda değerli örnekleri korur ve pahalı reaktiflerin kullanımını azaltır tekrarlanabilir sonuçlar için gerekli. Bu adımlarda, plakaların toplu fazla altı ay için hassasiyet ve tutarlılık sağlamak monte edilir.
Plaka hazırlığı takiben, kalite kontrol önlemleri plakaların bir toplu tutarlılığını kontrol etmek önemlidir. Bu amaçla, standart bir ek dört set bir plaka üzerinde çalışır. "5x standart" plaka performansını izler ve bireysel levhanın standartları karşılaştırıldığında hangi bir veri kümesi oluşturur. Her bir standardın on 10-kat seyreltme deney tasarımı sırasında kullanılır, alan hususlar dört nokta, her bir deney plakası üzerindeki standart eğri için kullanılır ve 5x standart levha olduğu gerektirir. Buna ek olarak, bir pozitif kontrol plakası geçerliliğini sağlamak için her bir plaka üzerine dahil edilmelidir.
Tipik olarak, Pr / Pb s birinden altı tahlil plakaları hazırlamak için 3-4 saat sürerource plaka; Bir araştırma laboratuvarında tek bir gün içinde on iki tabak hazırlamak için mümkündür. Her insan IFN alt tipi tahlil plakası onyedi Pr / Pb setleri inceler ve on beş deneysel örnekleri ağırlayacak beri, montaj bir gün 3,060 deneysel veri noktalarına kadar üretmek için kapasiteye sahip plakaların bir toplu üretir. Mah-PCR platformu Ham veri işlenir ve otomatik olarak önceden tasarlanmış bir analiz şablonu doldurmak için bir elektronik tablo uygulaması yazılımı programlama komut dosyalarını kullanarak monte edilebilir. Bu yöntem eller veri girişi, böylece önlenmesi kopyalama hatalarını en aza indirir ve araştırmacı veri analizi ziyade veri derleme odaklanmasını sağlar. Burada tarif edildiği gibi, bu, yüksek verimli QRT-PCR deneyi, insan ya da resus makak örneklerde interferon alt tiplerinin ekspresyonunu ölçmek için uygulanabilir ve diğer türler ya da homolog gen kümeleri için kullanmak üzere adapte edilebilir. plaka düzeni esnekliği kullanıcı astar değiştirmenize olanak sağlar / sonda genlerini terzi setleribelirli bir hücre tipi veya model sistem doğru faiz. Bu deney, bağışıklık tepkisi önemli olan sinyal mekanizmaları aydınlatmak için patojenler okuyan hücre kültürü modelleri ya da hastalık modelleri bağlamında, hasta numunelerinde IFN sentezleme imza ölçülmesi için tatbik edilebilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma CBER / FDA NIAID / NIH Kurumlararası Anlaşma YI-AI-6153-01, FDA / CBER içi fonlar ve FDA Tıbbi Önlemler Girişimi tarafından desteklenmiştir. TCT, MNB, VPM, LMS ve KDK ABD Enerji Departmen ve ABD arasında bir Kurumlararası anlaşma yoluyla Fen Eğitimi için, Oak Ridge Enstitüsü tarafından uygulanan Biyolojik Değerlendirme ve Araştırma Merkezi'nde araştırma Katılım Programı için randevu tarafından desteklenen Gıda ve İlaç İdaresi.
0.2mL PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
12-channel Electronic Pipette, 5-250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
2.0mL Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
8-channel Electronic Pipette, 15-1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
Matrix Filtered Pipet Tips, 30uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250uL | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
Rnase-Free 1.5mL Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |