Summary

Enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse d'exocytose

Published: January 26, 2015
doi:

Summary

L'objectif du présent Protocole est de développer une méthode qui permettra aux analyses de génomique fonctionnelle de la sécrétion des mastocytes. Le protocole est basé sur l'évaluation quantitative de la libération d'un gène rapporteur fluorescent cotrasfected avec le gène d'intérêt et des analyses en temps réel de la morphologie du granule sécrétoire.

Abstract

Mastocytes (MC) sont des cellules sécrétoires du système immunitaire qui accomplissent leurs fonctions physiologiques et pathologiques en libérant des médiateurs allergiques, inflammatoires et immunorégulateurs préformés et nouvellement synthétisés. Les médiateurs de MCs affectent plusieurs tissus et organes aboutissant à des réactions allergiques et immunitaires. La synthèse, le stockage et la libération des médiateurs MC sont très réglementés. Les médiateurs préformés sont emballés dans des granules sécrétoires cytoplasmiques (SG) qui fusionnent avec la membrane plasmique et libèrent leur contenu par exocytose régulée. Nous présentons un protocole basé sur la co-expression d'un gène d'intérêt avec un gène rapporteur qui est ciblée pour la GV et est libéré de manière régulée à côté des médiateurs endogènes SG. Le protocole permet haute résolution confocale quatre dimensions analyses de la MC SG et le suivi de leur calendrier de biogenèse d'exocytose déclenché. Ainsi, en utilisant ce protocole pour le dépistage de gènes entreEST pour leur impact phénotypique et fonctionnelle permet de déchiffrer les mécanismes moléculaires qui régissent la biogenèse et l'exocytose de la MC SG et l'identification des organismes de réglementation concernés. Ainsi, de nouvelles informations sur les mécanismes cellulaires qui représentent fonction MCs en matière de santé et de la maladie devraient être fournis.

Introduction

Mastocytes (MC) sont des cellules immunitaires qui sont les mieux connus pour leur implication dans des réactions allergiques et inflammatoires telles que l'arthrite, l'asthme, l'oesophagite à éosinophiles, la dermatite chronique et choc anaphylactique 1,2 ainsi que d'autres pathologies dont la maladie coronarienne et 3,5 le cancer 3,4. En outre, MCs jouent un rôle important dans l'immunité innée et adaptative, tant en défense de l'hôte contre les bactéries et les parasites et par la suppression de la réponse immunitaire, par exemple induire la tolérance 5,6 allogreffe.

MC proviennent de la moelle osseuse, le développement du CD34 + / CD117 + cellules progénitrices pluripotentes 7. Engagé moelle osseuse MC progéniteurs sont libérés dans la circulation sanguine et migrent dans les tissus périphériques de localisation principalement dans les tissus conjonctifs et les surfaces épithéliales 8. Maturation et différenciation terminale sont finalement atteints sous l'influence of cytokines au sein du milieu environnant de 8,9.

MCs peuvent être activés par un allergène (antigène, Ag), dont la rencontre entraîné la production d'immunoglobuline E (IgE) de type anticorps. La liaison d'une telle IgE aux récepteurs FceRI de la MC, suivie par une reticulation de cellule IgE liée à une nouvelle exposition à la même Ag, conduit à l'agrégation FceRI et l'initiation d'une cascade de signalisation qui aboutit à la dégranulation cellulaire [commentaire à 10,11] . MCs sont également activés, indépendamment des IgE, par neuropeptides 5,12, les toxines 13, bactérienne et antigènes viraux 14,15, un certain nombre de peptides chargés positivement collectivement dénommées sécrétagogues de base, cellules immunitaires et de cytokines 5,13,12,16 , 17. MCs sont également activés par beaucoup de leurs propres médiateurs libérés, qui amplifient encore la réponse inflammatoire.

MCs sont emballés avec des granules sécrétoires (SGS) qui contiennent immunomédiateurs réglementaires, y compris des amines vasoactives telles que l'histamine et de la sérotonine (chez les rongeurs), des protéoglycanes, des proteases telles que la tryptase et la chymase, facteur de croissance vasculaire endothéliale et de plusieurs cytokines et de chimiokines 8,9. Ces médiateurs sont "prêt à aller" et une fois MCs sont activées par un stimulus approprié, ces médiateurs sont libérés des cellules par exocytose régulée (de dégranulation) dans une affaire de secondes à quelques minutes 18,19. Cet événement initial est suivi de la synthèse de novo et la libération d'un large éventail de substances biologiquement puissants, y compris les metabolites de l'acide arachidonique, de multiples cytokines et de chimiokines 20,21,22. Libération de produits nouvellement synthétisés se produit indépendamment de presse SG. Collectivement, ces médiateurs initient précoce et la phase tardive réponses inflammatoires et allergiques. Par conséquent, la compréhension des mécanismes responsables de l'activation et de la dégranulation MC sont deux imp théorique et cliniqueOrtance.

La difficulté de manipuler génétiquement MCs primaires et de culture a entravé les tentatives pour élucider les mécanismes sous-jacents MC dégranulation qui sont encore mal résolus. Pour surmonter ce problème, nous avons développé un dosage à base rapporteur par co-transfection de la lignée cellulaire de la muqueuse de mât, rat leucémie basophiles (RBL) -2H3 (ci-après dénommé RBL) ou de moelle osseuse dérivés MCs (BMMCs) 30 avec un gène d'intérêt et neuropeptide Y (NPY) fusionné à DP monomère (mRFP), en tant que journaliste de SG.

NPY a déjà été démontré de récapituler le comportement des marqueurs de SG endogènes dans d'autres systèmes. En outre, parce que mRFP fluorescence est insensible au pH, l'expression de NPY-mRFP permet la visualisation des acides SG ainsi que l'évaluation quantitative de l'exocytose en utilisant des plaques à 96 puits et un lecteur de plaque à fluorescence. Nous avons montré que NPY-mRFP est livré à SGS acides de cellules RBL et BMMCs et est libérée par les cellulesd'une manière réglementée aux côtés de la cargaison de SG endogène (ce est à dire, β-hexosaminidase et la sérotonine) 30, 32. Ce protocole fournit une méthodologie basée imagerie à haute résolution qui permet de criblage de gènes d'intérêt pour leur phénotypique et fonctionnel incidence sur les caractéristiques de SG et la dégranulation dans des cellules RBL 32. Plus précisément, ce protocole permet un suivi en temps réel de MC SG et la quantification de leur zone de volume ou la taille, le nombre, la cinétique de l'assemblage, leur mouvement le long du cytosquelette de la cellule et leur fusion ultime avec la membrane plasmatique dans des conditions différentes. Par exemple, la sensibilisation des cellules avec DNP-IgE spécifique et déclencher les cellules avec un Ag multivalent (DNP de l'albumine de sérum conjugué) sous différentes perturbations (c.-à-knockdown de gènes d'intérêt, sur l'expression de gènes wt ou mutants, ou des manipulations pharmacologiques) et la comparaison aux cellules témoins.

Protocol

1. Préparation de RBL Culture Cellulaire médias Mélanger 500 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco faible taux de glucose (DMEM) avec 56 ml de sérum de veau fœtal (cela fait 10% de FBS), puis ajoutez 5,5 ml de pénicilline streptomycine (ce qui rend ~ 1% PEST). Filtrez les médias en utilisant 500-1000 ml Bottle-Top filtres à vide avec 0,22 um taille des pores et conserver à 4 ° C. 2. Culture de cellules RBL Cultiver les cellules RBL dans u…

Representative Results

En raison de la faible efficacité de transfection des MCs, les manipulations génétiques sont peu susceptibles de laisser un impact sur les lectures de la sécrétion moyenne mesurée par SGS médiateurs endogènes. Néanmoins, en établissant la co-expression complète du gène rapporteur NPY-mRFP et le plasmide co-transfecté dans les mêmes cellules, suivi des résultats NPY-RGRF exclusivement dans le suivi de la population de cellules qui exprime le gène d'intérêt. Par conséquent, l'avantage de ce dosa…

Discussion

Nous décrivons une stratégie innovante qui combine la quantification des MCs exocytose et quatre (x, y, z, t) quantifications de dimension par imagerie de temps écoulé en trois dimensions des SG dans les cellules vivantes en utilisant un gène rapporteur pour l'exocytose. Cette technique permet le dépistage des familles de protéines pour leur impact sur la fonction MC tels que SGS de surveillance à partir dès leur sortie de l'appareil de Golgi travers leur maturation, l'acquisition de la compétence …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr U. Ashery pour le don de NPY-mRFP ADNc. Nous remercions les Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, et Y. Zilberstein pour son aide précieuse à la microscopie et analyse d'images. Nous remercions également le Dr Joseph Orly pour la lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation israélienne des sciences, fondée par l'Académie israélienne des sciences (1139-1112 RS-E.).

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
DMEM Sigma-Aldrich D6046-500ML Warm in 37 °C water bath before use
Fetal Bovine Serum GE health care Life sciences SH30071.01
Penicillin-Streptomycin Life technologies
Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm Sigma-Aldrich CLS430769-1EA
Corning tissue-culture treated culture dishes Sigma-Aldrich CLS430167
Trypsin/EDTA Solution (TE) Life technologies R001100 Warm in 37 °C water bath before use
PIPES dipotassium salt Sigma-Aldrich 108321-27-3 
Calcium acetate hydrate Sigma-Aldrich 114460-21-8
Magnesium acetate tetrahydrate Sigma-Aldrich M5661 
L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) Sigma-Aldrich G1501
4 mm electroporation cuvettes cell projects EP-104
GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE Bio rad
Chambered coverglass Thermo scientific 155411
24 well, flat bottom Sigma-Aldrich CLS3524
Corning 96 well plates Sigma-Aldrich CLS3367 or CLS390
96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 Tecan
Calcium ionophore A23187 Sigma-Aldrich C7522 Avoid from direct light exposure
12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) Calbiochem P3766
anti-DNP monoclonal IgE Sigma-Aldrich D8406 
DNP-BSA/ DNP-HAS Sigma-Aldrich A6661 Avoid from direct light exposure
Triton-x-100 Sigma-Aldrich T8787
Confocal fluorescent microscope:
Zeiss LSM 510
Leica SP5
Nikon A1 inverted
Imaris software BITLANE
Microsoft exel or Prism or other analyses software
Other reagent:
Magnesium Chloride MERK 5833
Sodium chloride MERK 6404
Calcium chloride  MERK 2382
Bovine serum albumin  Sigma-Aldrich A4503
Glucose BDH Laboratories 284515V
Monosodium phosphate  MERK 5345
Sterile water

References

  1. Abonia, J. P., et al. Involvement of mast cells in eosinophilic esophagitis. J Allergy Clin Immunol. 126 (1), 140-149 (2010).
  2. Galli, S. J., Tsai, M. Mast cells in allergy and infection: versatile effector and regulatory cells in innate and adaptive immunity. Eur J Immunol. 40 (7), 1843-1851 (2010).
  3. Ribatti, D., Crivellato, E. The controversial role of mast cells in tumor growth. International Review of Cell and Molecular Biology. 275, 89-131 (2009).
  4. Ribatti, D., Crivellato, E. Mast cells, angiogenesis and cancer. Adv Exp Med Biol. 716, 270-288 (2011).
  5. Tsai, M., Grimbaldeston, M., Galli, S. J. Mast cells and immunoregulation/immunomodulation. Adv Exp Med Biol. 716, 186-211 (2011).
  6. Vries, V. C., Noelle, R. J. Mast cell mediators in tolerance. Curr Opin Immunol. 22 (5), 643-648 (2010).
  7. Kirshenbaum, A. S., et al. Demonstration that human mast cells arise from a progenitor cell population that is CD34(+), c-kit(+), and expresses aminopeptidase N (CD13). Blood. 94 (7), 2333-2342 (1999).
  8. Metcalfe, D. D., Baram, D., Mekori, Y. A. Mast cells. Physiol Rev. 77 (4), 1033-1079 (1997).
  9. Gilfillan, A. M., Austin, S. J., Metcalfe, D. D. Mast cell biology: introduction and overview. Adv Exp Med Biol. 716, 2-12 (2011).
  10. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. J Allergy Clin Immunol. 117 (6), 1214-1225 (2006).
  11. Rivera, J., Gilfillan, A. M. Molecular regulation of mast cell activation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 117 (6), 1214 (2006).
  12. Lagunoff, D., Martin, T. W., Read, G. Agents that release histamine from mast cells. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 23, 331-351 (1983).
  13. Depinay, N., Hacini, F., Beghdadi, W., Peronet, R., Mecheri, S. Mast cell-dependent down-regulation of antigen-specific immune responses by mosquito bites. J Immunol. 176 (7), 4141-4146 (2006).
  14. Abel, J., et al. Staphylococcus aureus evades the extracellular antimicrobial activity of mast cells by promoting its own uptake. J Innate Immun. 3 (5), 495-507 (2011).
  15. Avila, M., Gonzalez-Espinosa, C. Signaling through Toll-like receptor 4 and mast cell-dependent innate immunity responses. IUBMB Life. 63 (10), 873-880 (2011).
  16. Novak, N., Bieber, T., Peng, W. M. The immunoglobulin E-Toll-like receptor network. Int Arch Allergy Immunol. 151 (1), 1-7 (2010).
  17. Rudich, N., Ravid, K., Sagi-Eisenberg, R. Mast cell adenosine receptors function: a focus on the a3 adenosine receptor and inflammation. Front Immunol. 3, 134 (2012).
  18. Theoharides, T. C., Kempuraj, D., Tagen, M., Conti, P., Kalogeromitros, D. Differential release of mast cell mediators and the pathogenesis of inflammation. Immunol Rev. 217, 65-78 (2007).
  19. Caughey, G. H. Mast cell proteases as protective and inflammatory mediators. Adv Exp Med Biol. 716, 212-234 (2011).
  20. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  21. Metz, M., Maurer, M. Mast cells–key effector cells in immune responses. Trends Immunol. 28 (5), 234-241 (2007).
  22. Gordon, J. R., Burd, P. R., Galli, S. J. Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today. 11 (12), 458-464 (1990).
  23. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  24. Stenmark, H., et al. Inhibition of rab5 GTPase activity stimulates membrane fusion in endocytosis. EMBO J. 13 (6), 1287-1296 (1994).
  25. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).

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Cite This Article
Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis. J. Vis. Exp. (95), e52505, doi:10.3791/52505 (2015).

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