Influenza Virus Voortplanting in bevruchte kippeneieren
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
Influenza infectie is geassocieerd met ongeveer 36.000 doden en meer dan 200.000 ziekenhuisopnames per jaar in de Verenigde Staten. De continue opkomst van nieuwe influenzavirusstammen door mutatie en recombinatie bemoeilijkt de controle van het virus en vereist de permanente ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en vaccins. Het laboratoriumonderzoek van influenza is een betrouwbare en kosteneffectieve werkwijze voor de vermeerdering van het virus. Hier wordt een uitgebreid protocol waarin influenza A virus propagatie in vruchtbare kippeneieren, die consequent levert hoge titer virale voorraden. Kortom, zijn serum pathogeenvrije (SPF) bevruchte kippeneieren geïncubeerd bij 37 ° C en 55-60% luchtvochtigheid gedurende 10 – 11 dagen. Gedurende deze periode, kan ontwikkeling van het embryo gemakkelijk worden gecontroleerd met behulp van een ei candler. Virusinoculatie wordt uitgevoerd door injectie van het virus voorraad verricht naar de allantoïsholte behulp van een naald. Na 2 dagen incubatie bij 37 ° C, de eierengekoeld gedurende ten minste 4 uur bij 4 ° C. De eierschaal boven de luchtzak en het chorioallantoïsmembraan worden vervolgens voorzichtig geopend en de allantoïsvloeistof met het virus geoogst. De vloeistof wordt uit afval door centrifugatie geklaard porties verdeeld en overgebracht naar -80 ° C voor langdurige opslag. De grote hoeveelheid (5-10 ml virus bevattende vloeistof per ei) en hoge virustiter die meestal bereikt met dit protocol is het gebruik van eieren voor viruspreparaat voordelige wijze gemaakt, met name voor in vitro studies die grote hoeveelheden nodig virus waarbij hoge doseringen van hetzelfde virus voorraad nodig.
Introduction
Influenza A blijft een belangrijke bedreiging voor de menselijke gezondheid. Het is een potentieel verwoestende ziekte van de luchtwegen met een grote globale last veroorzaken tot 500.000 doden wereldwijd per jaar 1. Influenza virussen zijn in de familie Orthomyxoviridae en uitvoeren 8 negatieve-sense enkelstrengs RNA in hun genoom 1,2. De hoge veranderlijkheid (dwz antigene "drift") van het virale genoom voorkomt langdurige immuniteit. Bovendien influenza steeds resistent tegen antivirale geneesmiddelen 3.
De 2009 H1N1-grieppandemie gemarkeerd alle uitdagende kwesties in verband met influenza ziekte (pandemische stam, anti-virale resistentie, vertraagde de productie van vaccins). De formulering vaccin wordt jaarlijks vastgesteld door de World Health Organization voor de meest waarschijnlijke pathogene influenza stammen (een voor elk van H1N1, H3N2 en influenza B) 4. Omdat deze methode is gebaseerd op de voorspelde influenzastams, pathogene stammen worden soms ten onrechte geïdentificeerd en effectiviteit van het vaccin daalt dramatisch. Bovendien kan de verschijning van nieuwe influenzastammen deze preventieve programma's veroorzaken pandemische ziekte 2 te omzeilen.
De creatie van een universeel griepvaccin is ongrijpbaar 5 geweest. Daarom moet het onderzoek voort te zetten naar het begrijpen van de pathogenese van longschade. Om faciliteit laboratoriumonderzoek zijn verscheidene werkwijzen ontwikkeld voor virale isolatie en vermeerdering 6. Menselijke influenzavirussen kan worden geamplificeerd in verschillende zoogdiercel substraten. Echter, zijn het genereren van hoge titer virussen in grote hoeveelheden best bereikt in bebroede eieren. Het volgende protocol beschrijft een techniek voor influenza A virus verspreiding en opslag van bestaand virus voorraden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Influenza veroorzaakt een grote wereldwijde ziektelast, en werk gaat in het begrijpen van de pathogenese van longbeschadiging 7. Om vergemakkelijkt onderzoek op dit dodelijke ziekte, zijn verschillende methoden ontwikkeld om het influenzavirus 6 propageren. Hier beschrijven we een techniek om influenzavirus produceren kippeneieren. Het voordeel van deze methode is dat het zeer reproduceerbaar en resulteert in grote hoeveelheden hoge titer influenzavirus bestanden, die vaak nodig is voor in vitr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza — United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
