JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
면역학 및 감염병학

Моделирование жизненного цикла Эбола Вирус Меньше уровень биологической безопасности 2 Условия вирусом типа частиц, содержащих Tetracistronic Minigenomes

Published: September 27, 2014
doi:
10.3791/52381
, , ,
1Laboratory of Virology, Division of Intramural Research,National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 2Research Technology Branch, Division of Intramural Research,National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Summary

Работа с инфекционными вирусами Эбола ограничивается биобезопасности уровне 4 лабораторий. Tetracistronic minigenome содержащих репликации и транскрипции-компетентный вирус частицы (trVLPs) представляют собой систему моделирования жизненного цикла, который позволяет нам смело моделировать несколько инфекционных циклов при уровне биобезопасности 2 условия, опираясь исключительно на вирусных компонентов Эбола.

Abstract

Эбола вирусы вызывают тяжелые геморрагические лихорадки у человека и приматов, с тематических летальности достигает 90%. Там отсутствуют утвержденные вакцины или специфические методы лечения заболевания, вызываемого этими вирусами, и работать с инфекционными вирусами Эбола ограничивается биобезопасности уровне 4 лаборатории, значительно ограничивая исследования по этим вирусам. Жизненный цикл моделирования модельные системы вирус жизненного цикла под уровнем биобезопасности 2 условия; Однако, до недавнего времени такие системы не были ограничены ни отдельных аспектов вируса жизненного цикла, или одного инфекционного цикла. Tetracistronic minigenomes, которые состоят из вирусных Эбола некодирующих регионах, гена-репортера, и три вирусных генов Эбола, участвующие в морфогенезе, подающий надежды, и вступление (VP40, ГП 1,2, и VP24), может быть использована для производства репликацию и транскрипцию -competent вирусоподобные частицы (trVLPs), содержащие эти minigenomes. Эти trVLPs может непрерывно заразить клетки, экспрессирующие Эболавирусные белки, ответственные за генома репликации и транскрипции, что позволяет нам смело моделировать несколько инфекционных циклов при уровне биобезопасности 2 условия. Важно отметить, что вирусные компоненты этой системы являются исключительно получена из вируса Эбола, а не от других вирусов (как, например, имеет место в системах, использующих pseudotyped вирусы), и VP40, ГП 1,2 и VP24 не избыточно экспрессируется в этой системе , что делает его идеально подходит для изучения морфогенеза, почкованием и вход, хотя другие аспекты жизненного цикла вируса, такие как генома репликации и транскрипции также может быть смоделирована с помощью этой системы. Поэтому, tetracistronic trVLP анализ представляет собой наиболее полную систему моделирования жизненного цикла, доступной для Эбола вирусов, и обладает огромным потенциалом для использования в расследовании биологию Эбола вирусов в будущем. Здесь мы предоставляем подробную информацию об использовании этой системы, а также на ожидаемые результаты.

Introduction

Эбола вирусы возбудителем тяжелой геморрагической лихорадки у человека и приматов с случай летальности до 90% в человека вспышек 1. Хотя был достигнут значительный прогресс в последние годы в разработке вакцин, а также конкретные процедуры (обзор в 2,3), они не одобрены для использования человеком. Вирусные частицы Эбола имеют характерный нитевидную внешний вид с длиной около 1 мкм и диаметром 96 до 98 нм 4. А нуклеокапсидные образует ядро из вирусных частиц и состоит из 1) не-сегментного одноцепочечной отрицательной смысловой РНК генома, который кодирует гены 7 ebolavirus (рисунок 1), 2) нуклеопротеидной NP, которые encapsidates геном, 3 ) вирусной полимеразы комплекс, состоящий из L-полимеразы и его кофактора VP35, и 4) активатор транскрипции VP30. Кроме того, недавно было показано, что белок VP24 также связан с нуклеокапсидас 4. Нуклеокапсид окружен матричного пространства, в котором матрица белка VP40, который отвечает за морфогенеза и почкованием вирионов, комн. Вирусные частицы далее охватила, и заливали в этой оболочки является единственным поверхностный белок ГП 1,2, который является ответственным за прикрепления вириона и записи.

Работа с инфекционными вирусами Эбола должна быть выполнена в максимально изолированной лаборатории под уровнем биобезопасности (BSL) 4 условий, что ограничивает эту работу несколько объектов по всему миру. С целью изучения биологии этих вирусов или для разработки новых терапевтических условиях BSL2, исследователи опираются либо на рекомбинантного гиперэкспрессией Эбола вирусных белков, или на модельных системах жизненного цикла, оба из которых могут быть работали в отсутствии инфекционного вируса Эбола. Рекомбинантной экспрессии Эбола вирусных белков либо достигается от плазмид экспрессии или вирусных векторов. Особый случай этой стратегии являетсяпоколение вирионов или вирусоподобные частицы на основе других вирусов, чем Эбола вирусов (чаще всего ретровирусы или вирус везикулярного стоматита) в присутствии рекомбинантно экспрессировали GP 1,2, что приводит к генерации pseudotyped частиц, которые могут быть использованы для изучения запись процесс филовирусы и экрана для ингибиторов проникновения 5. Кроме того, рекомбинантные вирусы (например, вирус везикулярного стоматита), которые кодируют вирус Эбола GP 1,2 вместо собственного гликопротеина могут быть получены и использованы для изучения запись вируса под уровнем биобезопасности 2 условия 6.

Системы жизненным циклом моделирования формы систем обратного генетики, показывающих использование усеченных вирус Эбола генома аналогов (minigenomes), которые первоначально полученных из кДНК и затем воспроизведены и транскрибируемых вирус Эбола белков, предусмотренных в транс. Первая система minigenome для вируса Эбола была разработана более 15 лет назад 7, И с тех пор используется для изучения вируса Эбола генома репликацию и транскрипцию (обзор в 8,9). В этой системе monocistronic minigenome, состоящий из одного гена-репортера в окружении терминальных некодирующих регионах генома вируса Эбола (называется лидером и прицеп) (Рисунок 1) экспрессируется в клетках млекопитающих (как правило, путем транскрипции с помощью РНК-полимеразы Т7) вместе с вирусными белками L, VP35, VP30 и NP. Minigenome будет encapsidated НП, а затем воспроизвести и транскрибируется других нуклеокапсидных белков с использованием цис-действующие сигналы локализованные в начальный и конечный отрезки, что приводит к репортера деятельности, которая отражает эти два аспекта вируса жизненного цикла (рисунок 2).

Для моделирования дополнительные стадии вирусного жизненного цикла, транскрипции и репликации-компетентным вирусоподобная частица (trVLP) системы были разработаны, которые основаны на классических систем minigenome, но отличать The Aопо лни тельная экспрессия других вирусных белков VP24, VP40 и GP 1,2 из плазмид экспрессии 10,11. Наличие VP40 приводит к образованию trVLPs, которые несут GP 1,2 на их поверхности, и нести minigenome содержащих нуклеокапсида на внутренней стороне. Эти trVLPs можно использовать для заражения клетки-мишени, которые были либо pretransfected с плазмид экспрессии для L, VP35, VP30 и NP, для облегчения репликации и транскрипции minigenomes принесли в клетки-мишени в trVLPs 11, или наивны клетки-мишени (т.е. без плазмиды приводом выражения Эбола вирусных белков) 10. Это приводит к репортера активности в клетках-мишенях, который отражает репликацию minigenomes в клетки-продуценты, формообразования и почкования trVLPs, их вступления в клетках-мишенях, и 1) в случае pretransfected клеток-мишеней также генома репликацию и вторичного транскрипцию ( т.е. транскрипция вирусных белков продuced в клетках-мишенях) в клетках-мишенях, или 2) в случае наивных клеток-мишеней также первичной транскрипции (т.е. транскрипции вирусных белков принесли в клетки-мишени в trVLPs) (Рисунок 3). Важно отметить, что эти системы использовались только для моделирования одного инфекционного цикла, и рассчитывать на избыточной экспрессии всех вирусных белков, которые в случае VP24 и VP40 особенно проблематично, так как эти белки, как было показано, что сильные негативные регуляторы генома репликации и транскрипции, когда избыточно экспрессируется из плазмид 12,13. Кроме того, trVLP препараты, произведенные в этих системах содержат высокую долю неинфекционных частиц, создает проблемы для биохимического анализа инфекционных trVLPs 14.

Для того чтобы преодолеть эти проблемы, мы недавно разработали tetracistronic систему minigenome что, в дополнение к геном-репортером, также содержит гены, кодирующие для VP40, Г. П. 1,2 иVP24 (Рисунок 1). Как и в классической системы monocistronic minigenome, эта система приводит к получению trVLPs, которые могут инфицировать клетки-мишени (фигура 4) 15. Тем не менее, в отличие от классической системы minigenome, VP40, ГП 1,2, и VP24 производится после транскрипции вирусного генома, а не быть избыточно экспрессируется из плазмид. В результате, кинетика и уровни экспрессии этих белков гораздо более тесно имитировать те, что в течение всего жизненного цикла вируса, и, следовательно, отношение к инфекционным неинфекционных trVLPs увеличивается примерно в 500 раз в этой системе 15. Кроме того, с помощью этой системы можно было непрерывно проход tetracistronic minigenome содержащих trVLPs, моделирование нескольких инфекционных циклов. Таким образом, tetracistronic trVLPs являются в настоящее время наиболее комплексная система моделирования жизненного цикла доступны для изучения Эбола вируса биологию в условиях BSL2. Здесь мы предоставляем подробную информацию о использовать уплотнительныеF этой системы, а также от ожидаемых результатов.

Protocol

1 Расщепление клеток-продуцентов для начальной Производство trVLPs Удалить среды из 80-90% сливной 293 клетки культивировали в 75 см 2 колбы в высокой глюкозы модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, и 1x ручка / стрептококк (DMEM10 ). Промыть клетки дважды с 10 мл фосфатно-солевом буфере (PBS), осторожно, чтобы не сместить клетки, и добавляют 2 мл трипсина-ЭДТА в клетки. Инкубируйте клетки при комнатной температуре до тех пор, пока клетки показывают значительное округление при наблюдении под микроскопом (около 30 с). Выбить клетки, нажав колбу и добавить 8 мл DMEM10. Тщательно ресуспендирования клеток, осторожно пипеткой вверх и вниз до тех пор, суспензии отдельных клеток не наблюдается, если смотреть под микроскопом. Граф клеток с использованием автоматического счетчика клеток. Развести клетки 2 х 10 5 клеток на мл в DMEM10. Пипетка 2 мл клеточной суспензии на лунку на 6-луночных планшетах (4 х 105 клеток на лунку). Инкубируйте пластин в увлажненном инкубаторе культуры ткани при 37 ° С с 5% CO 2. 2 Трансфекцию клеток-продуцентов для начальной Производство trVLPs 24 часа в сутки после разделения клетки (рисунок 5 с обзором сроках эксперимента), пипетка ДНК плазмиды 15 (на сумму см таблицу 1) в стерильный 2 мл криопробирку использованием отфильтрованных советы. Добавить 100 мкл OptiMEM на лунку с ДНК. Vortex смесь коротко и мягко спин вниз трубы с использованием Microfuge. Если несколько скважин для трансфекции с одинаковыми плазмид, Mastermix в течение нескольких скважин могут быть сделаны. Кратко вихрь флакон с транзитной LT1 перед использованием. Добавить 7,5 мкл Transit LT1 за хорошо к разбавленной ДНК. Аккуратно вихрь смесь, заботясь, чтобы не собирать жидкость в крышке криопробирку, и выдержать в течение 15 минут при комнатной температуре. Аккуратно перемешайте трансфекцииКомплекс с помощью пипетки вверх и вниз. Добавить 100 мкл трансфекции комплексов по каплям в каждую лунку. Рок пластину вперед / назад и из стороны в сторону, чтобы распределить трансфекции комплексов. Не вращать пластину так как это вызовет неравномерное распространение трансфекции комплексов. Вернуться клетки в инкубатор. После 24 ч, удалить супернатант от клеток. Добавить 4 мл DMEM с 5% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1x ручка / стрептококк (DMEM5) к клеткам. Этот шаг может быть сделано в течение 3 скважин в то время, без сушки в лунки, при условии, лунки содержат идентичные образцы (в противном случае, вследствие самостоятельного усиления природы trVLPs в этой системе, перекрестное загрязнение может стать проблемой, и этот шаг нужно сделать одну скважину, в то время). Вернуться клетки в инкубатор. 3 Получение клеток-мишеней Сплит 293 клеток, как описано в разделе 1, посева 4 х 10 5 клеток в 2 мл DMEM10 на лунку6-луночный планшет. 24 часа в сутки, после расщепления клеток-мишеней и 24 ч до заражения, трансфекции клетки-мишени, как описано в разделе 2 с использованием ДНК составляет в таблице 1, и 4,5 мкл Транзит LT1 на лунку. 4 заражение клеток-мишеней и урожай клеток-продуцентов Перенесите супернатанатах клеток-продуцентов до 15 мл пробирок. Снимите и выбросьте оставшийся супернатант, используя вакуумный шланг. Добавить 250 мкл лизирующего буфера Glo к клеткам. Центрифуга супернатант течение 5 мин при 800 х г и комнатной температуре, чтобы очистить образцы клеточных остатков. Удалить супернатант из одной скважины клеток-мишеней. Осторожно добавить 3 мл очищенной производитель клеточного супернатанта с клетками-мишенями, используя низкую скорость пипетки. Избегать пипеткой непосредственно на клетки, чтобы избежать прерывания клеточный монослой. Этот шаг должно быть сделано одну скважину за один раз. Когда все образцы были транспривилегированных, вернуться в клетки-мишени в инкубатор, чтобы позволить осаждение trVLPs и заражение клеток-мишеней. После 15 мин инкубации при комнатной температуре в буфере для лизиса Glo, ресуспендирования клеток-продуцентов в буфере для лизиса с помощью микропипетки установлен на 150 мкл, и переноса образца в 2 мл криопробирку. В этот момент, лизаты могут быть заморожены при -80 ° С, либо непосредственно измеряли, как описано в разделе 6. 24 часа в сутки после заражения, удалите супернатант от клеток-мишеней. Добавить 4 мл DMEM5 на лунку с клетками. Этот шаг может быть сделано до трех скважин, в то время, если скважины содержат идентичные образцы (иначе, в связи с самостоятельной усиления характера trVLPs в этой системе, перекрестное загрязнение может стать проблемой, и этот шаг должен быть сделано одну скважину, в то время). 5 Урожай клеток-мишеней для одного цикла инфекции Если только один инфекционный цикл должен быть наложен, по 72 ч после заражения удалить тОн супернатанта от клеток-мишеней с помощью вакуумного шланга. Урожай клеток в 250 мкл Glo буфера для лизиса, как описано в разделе 4 для клеток-продуцентов. 6. Урожай клеток-мишеней и непрерывной пассажи trVLPs Если trVLPs должны быть постоянно пассируют, подготовить новый набор клеток-мишеней, как описано в разделе 3 таким образом, что они готовы к инфекции 72 ч после инфекции первого набора клеток-мишеней (рисунок 5). Infect новый набор клеток-мишеней, как описано в разделе 4 (с использованием первого набора клеток-мишеней вместо клеток-продуцентов). Повторите эти действия каждый 72 час. 7 Анализ активность репортера Если клеточные лизаты были заморожены, оттаивают их при комнатной температуре. Убедитесь, что образцы достигли комнатной температуры перед измерением. Разморозить необходимое количество (40 мкл на пробу) из Renilla Glo буфере для анализа (в идеале заморожены ЯN аликвоты) при комнатной температуре. Убедитесь, что буфер имеет комнатную температуру перед измерением. Добавить 1/100-й объем Renilla Glo подложки в буфере для анализа Renilla Glo получить Renilla Glo реагента, и перемешать с помощью встряхивания. Пипетка 40 мкл реагента Renilla Glo в белый 96-луночный планшет. Добавить 40 мкл образца к реагенту Renilla-Glo. Подождите 10 минут, затем измерить образцы в люминометре помощью время интеграции 1 сек.

Representative Results

Трансфекцию 293 клеток-продуцентов с плазмиды экспрессии, кодирующий Вирус Эбола нуклеокапсида белки NP, VP35, VP30, и L, tetracistronic minigenome и аксессуары T7-полимеразы приводит к minigenome репликации и транскрипции и репортера деятельности, что легко обнаруживается в 72 ч (рис 6 ). Важно отметить, что наблюдается активность репортера (10 5,6 люминесценции в относительных единицах (RLU)) превышает отрицательного контроля, в котором плазмида экспрессии, кодирующий L был исключен из трансфекции (10) 3 RLU более чем на 2 бревна. Низкий уровень активности наблюдается даже в отсутствии L, скорее всего, в связи с загадочным промоутер в minigenome плазмиды. Клетки-мишени, инфицированные trVLPs из супернатанта клеток-продуцентов на самом деле показывают несколько повышенный уровень активности репортерного по сравнению с клеток-продуцентов, а значения достигают между 10 и 10 6 7 RLUS, в зависимости от прохода. В отличие от этого, WКурица супернатант клеток-продуцентов-L контрольных пассированные на клетки-мишени, экспрессирующие (все белок нуклеокапсида, в том числе L), репортер активность не превышает фоновый шум на фотометра (около 10 2 RLU). Tetracistronic trVLP анализ может быть использован для изучения жизненного цикла Эбола вирусов. Например, заражение 293 клеток с trVLPs зависит от наличия факторов прикрепления, такого как TIM-1 16, который должен быть обеспечен в транс в этих клетках. Следовательно, в tetracistronic trVLP анализа падение активности репортера в клетках-мишенях примерно в 100 раз наблюдается в отсутствие Tim-1 (7А). Роль конкретных (вирусных или клеточных) белков в вирусной жизненного цикла также можно оценить, используя технологию RNAi вместе с этим подходом. В качестве примера, РНК-интерференции опосредовано вниз регулирования результатов L к падению репортера активностью около 100 раз, что отражает центральную роль L врепликации и транскрипции (7В) 7. Кроме того, можно непосредственно манипулировать minigenome для оценки влияния мутаций на жизненном цикле вируса. В качестве примера, когда VP24-выражение из minigenome упраздняется путем введения 3 стоп-кодонов непосредственно после стартового кодона, репортер деятельность в клеток-продуцентов не сильно изменилась; Тем не менее, активность репортера в клетках-мишенях снижается примерно в 20 раз после одного прохода, и 400-кратного после двух пассажей, что указывает на роль VP24 в производстве инфекционных trVLPs (7С) 15. Рис.1 Структура генома вируса Эбола, а также monocistronic и tetracistronic minigenomes. Кодирование регионы для вируса Эбола белка показаны красным (NP,VP35, VP30, и L), желтый (VP40 и VP24) или синий (GP 1,2) коробки. Некодирующая регионы (NCRs) показаны зеленым цветом, с лидером и прицепов регионов указанных. Индекс показывает, какой был использован вирусный NCR для присоединения кодирующие. Область кодирования для репортера (REP) показан на фиолетовый. Фигура 2 Monocistronic minigenome анализ. Клетки трансфицируют плазмид экспрессии для вируса Эбола нуклеокапсидных белков (NP, VP35, VP30, L), monocistronic minigenome (мг) и Т7-полимеразы. Minigenome первоначально транскрибируются Т7 полимеразы (а) в unencapsidated minigenome РНК в той же ориентации, что и вирусного генома (вРНК), который затем encapsidated НП (б). Это encapsidated вРНК тиражируется через дополняют minigenome РНК (кРНК) промежуточноеediate (с), а затем транскрибируется в мРНК-репортеров (г), которые переведены на репортерного белка (е). Рисунок 3 trVLP проба с monocistronic minigenome. Клетки трансфицируют плазмид экспрессии для компонентов minigenome анализа (Эбола вирус нуклеокапсидных белков NP, VP35, VP30, L, monocistronic minigenome и T7-полимеразы), а также VP40, Г. П. 1 , 2 и VP24. Это приводит к образованию trVLPs которые включают minigenome содержащих нуклеокапсидов (F). Эти trVLPs затем могут заразить клетки-мишени (г), которые либо pretransfected с плазмид экспрессии для НП, VP35, VP30, и L (вверху), в результате чего репликации и вторичной транскрипции (г) приводит к репортера выражения (е), или наивны Клетки-мишени (внизу), в результате чего первичной транскрипции минigenomes (ч), а также приводит к экспрессии репортерного (е). Фигура 4 trVLP проба с tetracistronic minigenome. Клетки трансфицируют плазмид экспрессии для вируса Эбола нуклеокапсидных белков (NP, VP35, VP30, L), tetracistronic minigenome (мг) и Т7-полимеразы. Исходное транскрипции (а), инкапсидации (б), геном репликации (с) и транскрипцию (D), а также перевод (е) происходит как в monocistronic minigenome анализа. Тем не менее, в дополнение к репортерной мРНК, мРНК для VP40, ГП 1,2 и VP24 также транскрипции от tetracistronic minigenome, в результате чего формирование trVLPs (F). Эти trVLPs заражают клетки-мишени, которые были pretransfected с плазмид экспрессии для нуклеокапсида белков NP, VP35, VP30, и L, а также вируса клеточной ЭболаКоэффициент крепления Tim-1, в результате чего генома репликации и транскрипции, и производства trVLPs которые могут быть использованы для инфицирования свежих клеток-мишеней. Рисунок 5 Ремень из tetracistronic trVLP анализа в течение 3 последовательных проходов. Дни для посева клеток (ы), трансфекции клеток (т), инфицировать клетки (I), среднего изменения (с) и сбор клеток и trVLPs (ч) являются указывается в течение трех последовательных проходов (указаны стрелками). Рис.6 Типичные уровни репортера активности, наблюдавшейся в tetracistronic trVLP анализа. Tetracistronic trVLP анализ проводили в течение 5 пассажей после protocол изложены в этой рукописи. В качестве отрицательного контроля плазмида экспрессии, кодирующий L был опущен (-L) от трансфекции клеток-производителей р0. Клетки-мишени в проходах P1 до P5 трансфицировали плазмидами экспрессии для всех нуклеокапсидных белков, в том числе L. фоновый шум фотометр указывается как пунктирной линией. Средства и стандартные отклонения 4 биологических повторяет из 3 независимых экспериментов. Рисунок 7 Оценка влияния различных вирусных и клеточных факторов на вирусной жизненного цикла с использованием tetracistronic trVLPs. (А) Tim-1 в качестве фактора крепления. Клетки-мишени, которые были pretransfected с экспрессии плазмид, кодирующих белки нуклеокапсида и с или без плазмидой, кодирующей для Tim-1 (описанного в 15) были инфицированы Tetracistronic trVLPs. 72 ч после инфекции активность репортера в P1 целевых клеток было определено. Средства и стандартные отклонения 4 биологических повторяет из 4-х независимых экспериментов. (B) Влияние РНК-интерференции нокдаун L на генома репликации и транскрипции. Клеток-мишеней, которые были pretransfected с плазмид экспрессии для нуклеокапсидных компонентов, Тим-1 и микроРНК, направленные против L (анти-Д) или связаны белок (анти-GFP), (описано в 15) были инфицированы tetracistronic trVLPs. 72 ч после инфекции активность репортера в P1 целевых клеток было определено. Средства и стандартные отклонения 5 биологических повторяет из 2 независимых экспериментов. (C) Влияние мутаций в minigenome на trVLP инфекционности. Tetracistronic trVLP анализ проводили с использованием либо дикого типа minigenome (4cis-WT) или minigenome в 3, которые стоп-кодоны были введены сразу после стартового кодона VP24, отмены, экспрессирующих OF этот белок, но введение лишь минимальные изменения в minigenome в отношении длины, состав нуклеиновых кислот, вторичных структур и т.д. активность репортера в P0, P1 и P2 измеряли 72 ч после трансфекции / инфекции. Средства и стандартные отклонения 3 биологических повторяет из 3 независимых экспериментов. Производитель Клетки (p0) Клетки-мишени (P1 и выше) pCAGGS-NP 125 125 pCAGGS-VP35 125 125 pCAGGS-VP30 75 75 <td height = "19" стиль = "высота: 19px;"> pCAGGS-L 1000 1000 p4cis-вРНК-RLuc 250 – pCAGGS-T7 250 – pCAGGS-TIM1 – 250 Таблица 1 составляет ДНК для трансфекции. Объем каждой плазмиды, необходимого для трансфекции производителей и клеток-мишеней показано в нг на лунку 6-луночного планшета. Все плазмиды описаны в ваттах и соавт 15.

Discussion

Tetracistronic trVLP анализа, описанного в этой рукописи позволяет моделировать вируса жизненного цикла Эбола в течение нескольких инфекционных циклов. Важно отметить, что trVLPs произведенные в этой системе не содержат генетическую информацию для нуклеокапсидных белков NP, VP35, VP30, и L, которые вместе составляют почти 60% генома вируса Эбола, и являются существенными для репликации вируса. Скорее, эти белки должны быть предоставлены в клетки-мишени в транс из плазмид экспрессии, и любой инфекции клеток, не экспрессирующих все 4 из этих белков является неудачной. Важно отметить, что нет никаких доказательств генетической рекомбинации для филовирусы, и нет гомологичные регионы распределяются между tetracistronic minigenome и плазмид экспрессии для нуклеокапсидных белков. Поэтому, имеет пока ни практические свидетельства, ни любой теоретической основой, что можно было бы предусмотреть также возможность создания полноразмерных вирус Эбола геномов, которые могут затем потенциально способны привести кпроизводство инфекционных вирусов Эбола, что делает данную систему безопасной для использования в условиях BSL2.

Есть два важных шагов в tetracistronic trVLP анализе которые находятся под влиянием экспериментальных условиях, то есть производства trVLPs, и инфекция клеток-мишеней с этими trVLPs. Производство trVLPs зависит от высоких уровней minigenome репликации и транскрипции, который, в свою очередь, зависит от эффективности трансфекции высокой. Трансфекция эффективность может быть легко оценена путем включения -L контроль, в котором плазмида экспрессии для L обменивается на экспрессии плазмиды, кодирующей EGFP. Трансфекции ставки в этих условиях должна превышать 50% осмотром с флуоресцентным микроскопом 24 часов после трансфекции. Кроме того, клетки должны быть свободны от микоплазм, так как в нашем опыте загрязнение микоплазмой резко ухудшает minigenome репликацию и транскрипцию (неопубликованные данные). Благодаря своей высокой transfectability 293 CEзаполняет в клеточной линии выбора для trVLP анализов; Тем не менее, эти клетки являются относительно слабо подвержен (хотя и не полностью преломления) к заражению вирусом Эбола 16. Экспрессия фактора вложения, например, Тим-1 повышает инфекцию 293 клеток с trVLPs приблизительно в 100 раз, и имеет решающее значение для успеха этой системы в течение нескольких проходов.

В то время как tetracistronic trVLPs не собственных копий самостоятельно, они собственных копий в клетках, которые экспрессируют Нуклеокапсид белки. Таким образом, меры предосторожности должны быть приняты, чтобы избежать перекрестного загрязнения между лунками, содержащих различные trVLPs (например, с разными мутациями в minigenome). С более технической точки зрения, в связи с большой разницей между положительными и отрицательными сигналами в данном анализе (около 4 ствола), перекрестные помехи между образцами при измерении активности люциферазы может быть проблемой; Тем не менее, это может быть легко избежать, оставив одну пустую хорошо между каждой пробы в96-луночный планшет для измерения активности люциферазы.

Есть множество возможных применений tetracistronic trVLPs. Очевидно, они хорошо подходят для изучения вступление филовирусов частиц, так как инфекционные trVLPs имеют типичный нитевидная структура инфекционных филовирусы 14, и содержат те же вирусные компоненты, как филовирусов частиц. Важно отметить, что они не содержат компоненты других вирусов, как это имеет место при использовании pseudotyped вирионы или вирусоподобные частицы, такие как ретровирусных частиц, имеющих GP 1,2, или рекомбинантными вирусами, такими как рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, экспрессирующих GP 1,2 . Требование факторов прикрепления при использовании 293 клеток как клеток-мишеней в этой системе могут быть использованы для скрининга и исследовать роль таких факторов прикрепления, в то время как роль других клеточных факторов, таких как тех, кто участвует в генома репликации и транскрипции, а также морфогенез и бутондинь, могут быть исследованы с использованием технологии РНК-интерференции. Эффект мутаций в вирусных белков на вирусной жизненного цикла также могут быть изучены, хотя надо иметь в виду, что в то время как VP40, ГП 1,2, и VP24 выражены после вирусной транскрипции, выражение других вирусных белков достигается из выражения Плазмиды, так что эффекты, связанные с избыточной экспрессии этих белков должны быть приняты во внимание. Кроме того, следует позаботиться, что мутации в minigenome не существенно изменить длину minigenome, так как репортер деятельность напрямую зависит от minigenome длины 15. Наконец, так как tetracistronic minigenomes являются вирусные аналоги генома, которые несут вирусные гены, и тиражируются по вирусной полимеразы комплекса, она должна быть также предусмотрена возможность изучения эволюции этих генов в ответ на мутации в условиях BSL2. Таким образом, в то время как дальнейшие исследования по-прежнему необходимы в этом направлении, она должна быть возможность, например, ввести субоптимальныммутации в генах в пределах minigenome а затем прохода trVLPs пока бесплатные мутации не возникают.

Одним из ограничений на tetracistronic trVLP анализа, который должен иметь в виду тот факт, что, хотя модели большую часть жизненного цикла вируса, первичной транскрипции в клетках-мишенях не моделируется с помощью этой системы, так как клетки-мишени должны выразить нуклеокапсида белков в транс Для того, чтобы trVLPs повторить. Если первичной транскрипции должен быть оценен, то можно использовать наивные клетки-мишени 10; Тем не менее, в этом случае нет репликации генома не происходит в клетках-мишенях, и никаких дальнейших инфекционные trVLPs не производится, прерывание инфекции. Это основная проблема, которая не может быть преодолена без оказания trVLPs полностью самовоспроизводящихся, включив гены Нуклеокапсид белков в minigenome, которые бы де-факто превратить их в инфекционных рекомбинантных вирусов Эбола. В самом деле, EbolА вирусы, экспрессирующие люциферазы или другие репортеры были получены и могут быть использованы для оценки и изучения генома репликации и транскрипции 17,18; Однако, их использование ограничено BSL4 лабораторий. Кроме того, он должен иметь в виду, что в то время как VP40, ГП 1,2, и VP24 выражены с вирусного генома аналога, их положение в minigenome (2-й, 3-й и 4-й транскрипции блок) не совпадает с их положение в вирусном геноме (3-й, 4-й и 6-й транскрипции блок), которые могли бы повлиять на их абсолютные уровни экспрессии, а также их относительные уровни экспрессии по отношению друг к другу.

В целом, tetracistronic trVLP анализ представляет собой наиболее полную систему моделирования жизненного цикла для Эбола вирусов доступных на сегодняшний день, и позволяет моделировать генома репликации и транскрипции, формообразования частиц и бутонизации, а также привязанности и анпопробуйте в клетки-мишени более нескольких инфекционных циклов. Как таковая, она имеет огромный потенциал для использования в расследовании биологию Эбола вирусов в условиях BSL2.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы очень благодарны Боб Фишер (Л.В., DIR, NIAID, NIH), который выступал в качестве рассказчика, а также Остин Атман (RTB, DIR, NIAID, NIH) и Меган Морган (DOHS, ПРС, OD, NIH) для их помощь с созданием фильма, сопровождающей эту рукопись. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) за критическое прочтение рукописи. Это исследование было поддержано Исследовательским Программы Intramural НИЗ, NIAID.

Materials

75cm2 cell culture flask Corning  430641
DMEM Sigma D6546 preheat to 37°C prior to use
FBS Life Technologies 26140-079 heat inactivate 30 min @ 56°C
L-Glutamine Life Technologies 25030-081 100X 
Pen Strep Life Technologies 15070-063 100X 
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200-056
PBS 8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature 
6-well plates Costar 3516
Opti-MEM I Life Technologies 31985-070
Transit LT1 Mirus MIR 2300
Glo lysis buffer Promega E2661
Renilla Glo luciferase assay system Promega E2720
96-well assay plate (white) Costar 3912
Modulus microplate luminometer Turner Microsystems 998-9300
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuhn, J. H., et al. Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants. Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).
  2. Falzarano, D., Feldmann, H. Possible leap ahead in filovirus therapeutics. Cell research. , (2014).
  3. Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. Current ebola vaccines. Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).
  4. Beniac, D. R., et al. The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy. PloS one. 7, e29608 (2012).
  5. Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L., Enna, S. J. Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus. Current protocols in pharmacology. , (2010).
  6. Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry. J Virol. 84, 163-175 (2010).
  7. Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. J Virol. 73, 2333-2342 (1999).
  8. Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses. Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).
  9. Hoenen, T., Feldmann, H. Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses. Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).
  10. Hoenen, T., et al. Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24. J Virol. 80, 7260-7264 (2006).
  11. Watanabe, S., et al. Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics. J Virol. 78, 999-1005 (2004).
  12. Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription. Virology. 403, 56-66 (2010).
  13. Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome. J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).
  14. Spiegelberg, L., et al. Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles. J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).
  15. Watt, A., et al. A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity. J Virol. , (2014).
  16. Kondratowicz, A. S., et al. T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).
  17. Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals. Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).
  18. Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. J Virol. 86, 11779-11788 (2012).

Tags

Ebola VirusVirus-like ParticlesTetracistronic MinigenomesBiosafety Level 2Virus Lifecycle ModelingReplication And Transcription-competent Virus-like ParticlesVP40GP12VP24MorphogenesisBuddingEntryGenome ReplicationTranscription

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hoenen, T., Watt, A., Mora, A., Feldmann, H. Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes. J. Vis. Exp. (91), e52381, doi:10.3791/52381 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image