Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.
جيبسون التجمع (GA) الاستنساخ يوفر بديلا السريع، وموثوق بها، ومرنة لأساليب استنساخ DNA التقليدية. كنا GA لخلق البلازميدات مخصصة للتعبير عن الجينات الخارجية في الخلايا الجذعية الجنينية (mESCs). التعبير عن الجينات الخارجية تحت سيطرة SV40 أو المروجين الفيروس المضخم للخلايا البشرية يقلل بسرعة بعد ترنسفكأيشن إلى mESCs. وهناك علاج لهذا التعبير تقلص هو استخدام البشري استطالة عامل 1 ألفا (hEF1α) المروج لدفع التعبير الجيني. ناقلات البلازميد التي تحتوي على hEF1α ليست كما المتاحة على نطاق واسع SV40- أو البلازميدات التي تحتوي على CMV، وخاصة تلك التي تحتوي على N-أيضا محطة 3xFLAG-العلامات. بروتوكول الموصوفة هنا هو طريقة سريعة لخلق البلازميدات معربا-FLAG الموسومة CstF-64 وCstF-64 متحولة تحت تنظيم التعبيري من المروج hEF1α. يستخدم GA مزيج من نوكلياز خارجية DNA، البلمرة DNA ويغاز DNA لجعل استنساخ تداخل نهايات شظايا الحمض النووي الممكنة.واستنادا إلى السلطات الوطنية المعينة قالب كان لدينا المتاحة، قمنا بتصميم يبني لدينا ليتم تجميعها في تسلسل واحد. تصميم لدينا تستخدم في أربعة أجزاء DNA: pcDNA 3.1 ناقلات العمود الفقري، hEF1α المروج جزء 1، hEF1α المروج جزء 2 (الذي يتضمن 3xFLAG العلامة شراؤها باعتبارها جزء DNA الاصطناعية المزدوج تقطعت بهم السبل)، وإما CstF-64 أو محدد CstF-64 متحولة. تم تحميلها متواليات من هذه الشظايا إلى جيل أداة التمهيدي لتصميم الاشعال PCR المناسبة لتوليد شظايا الحمض النووي. بعد PCR، كانت مختلطة مع شظايا الحمض النووي تم تجميعها متجه تحتوي على علامة انتقائية ورد فعل الاستنساخ GA. تم عزل البلازميدات من المستعمرات البكتيرية تحولت الفردية. وقد تم الشاشة الأولى من البلازميدات من تقييد الهضم، تليها التسلسل. في الختام، GA يسمح لنا لخلق البلازميدات مخصصة للتعبير الجينات في 5 أيام، بما في ذلك بناء شاشات والتحقق.
تعتمد إجراءات استنساخ DNA التقليدية على استخدام الانزيمات تقييد ليلتصق الحمض النووي والحمض النووي يغاز للانضمام إلى شظايا الحمض النووي معا. جيل من بنيات التعبير مخصص يحتوي شظايا الحمض النووي مختلفة هو إجراء متسلسل يتضمن الانقسام من الحمض النووي مع واحد و / أو نوكليازات الاقتطاع الداخلية المتعددة والإدراج لاحق من شظايا الحمض النووي من خلال ربط. العيب الرئيسي من هذا الإجراء هو أن إنزيمات تقييد مناسبة لواحدة من شظايا الحمض النووي قد يكون من الصعب تحديد (أي، قد يكون لديك عدة مواقع الانقسام) تقديم استنساخ DNA الناجح للبروتين كامل طول الاهتمام مستحيلة. ولذلك، جيل التعبير العرف يبني تحت تنظيم النسخي من نوع محدد المروجين خلية فعالة مع تخصيص البروتين علامات يتطلب تصميم دقيق للغاية. وإنما هو أيضا تقنية الزمنية وتستغرق والعمل. في الآونة الأخيرة، وصفت عدة تقارير منهجيات لتجميع multipلو مختلفة شظايا الحمض النووي الاصطناعي في تسلسل مستمر في نفس الوقت في أي ردود فعل واحد أو خطوتين من دون استخدام تقييد الانزيمات 1-3. والاستنساخ رد فعل من خطوة واحدة (باستثناء جميع الخطوات التحضيرية)، ويعتمد على استخدام مزيج من نوكلياز خارجية DNA، البلمرة DNA، DNA يغاز 2،3 وينتهي متداخلة من شظايا الحمض النووي (الشكل 1). حيث لا يوجد استخدام الانزيمات التقييد، شظايا الحمض النووي من أي حجم وتكوين تسلسل (باستثناء تسلسلات متكررة جدا) يمكن أن تنصهر معا في بناء سلس. في الآونة الأخيرة، عدة التجارية (جيبسون التجمع؛ GA) أصبحت لردود الفعل استنساخ خطوة واحدة المتاحة. هذه المجموعة تسمح التجمع كفاءة السريع وتكلفة أي شظايا الحمض النووي في ناقل واحد مع المروجين مخصصة وعلامات البروتين.
والمتاحة على نطاق واسع ناقلات التعبير البلازميد استعمالها للتعبير عن البروتينات الخارجية في الثدييات نماذج ثقافة الخلية غالبا ما تكون تحت ريج النسخيulation من الفيروس المضخم للخلايا الفيروسية (CMV) أو قردي فيروس 40 (SV40) المروجين. توفر هذه المروجين الفيروسي التعبير عابرة القوي للبروتينات الخارجية في معظم نماذج الثدييات القائمة على الثقافة الخلية. ومع ذلك، جيل من خطوط الخلايا معربا عن ستابلي البروتينات الخارجية غالبا ما يكون غير ناجحة بسبب إسكات النسخي من CMV أو المروجين SV40 خلال 4،5 عملية التأسيس. وبالإضافة إلى ذلك، فإن SV40 وCMV الفيروسي المروجين لا تشجع بما فيه الكفاية للتعبير عن البروتينات الخارجية في الخلايا اللمفاوية من النسب أو الخلايا الجذعية الجنينية 6،7. الحل لبقصور المروجين الفيروسي هو استخدام قوي التأسيسي المروجين غير الفيروسية 8-10. واحد يتميز جيدا المروج غير الفيروسية التأسيسي قوي المنشأ البشري هو عامل استطالة 1α (hEF1α) المروج (تشارك hEF1α في الحفز للجمعية التي تعتمد على GTP من أمينوأسيل-الحمض الريبي النووي النقال لريبوسوم 11). ومع ذلك،ناقلات التعبير التي تحتوي على مروج hEF1α ليست كما المتاحة على نطاق واسع للمروج الفيروسي تحتوي على البلازميدات، وخاصة تلك التي تحتوي على أيضا 3 × FLAG في نهاية محطة الأمينية من البروتين من الفائدة.
وتشارك 64،000 ميغاواط بروتين عامل تحفيز الانقسام (CstF-64) في 3 "معالجة نهاية معظم من mRNAs 12،13، بما في ذلك تعتمد على التكرار من mRNAs هيستون 14،15. وأعرب عن CstF-64 في جميع الأنسجة الجسمية 12. في عزر الاعتراف RNA بربط سلاسل RNA GU الغنية على محاضر الوليدة المصب للانشقاق وتذييل بعديد الأدينيلات الموقع 16. هذا الربط من CstF-64 إلى ما قبل مرنا يعزز الانقسام endonucleolytic كفاءة نص الناشئ.
هنا، يتم وصف بروتوكول يستخدم PCR التضخيم من شظايا الحمض النووي، وهو جيبسون عدة التجمع الاستنساخ (والذي يتضمن الخلايا البكتيرية المختصة كيميائيا) لإنتاج ناقلات مخصصة ل3xFLAG الموسومة م[أوس] CstF-64 أو متحولة CstF-64 إلى الأمينية نهاية طرفية في ظل تعبير عن hEF1α المروج 1.
الاستخدام الناجح للGA الاستنساخ ينبغي أن يسبق دائما إلى تصميم دقيق للبناء كاملة (الشكل 2 والشكل 3).
ينصح التحقق دقيق لتسلسل التمهيدي التي صممها جيل الأداة التمهيدي أيضا إلى حد كبير. قد يتم إنشاء الاشعال لGA دون استخدام الجيل الأداة التمهيدي. ومع ذلك، استخدام الأداة هو التوصية للغاية، لأنه يبسط عملية. عموما، يجب أن يكون التمهيدي لGA استنساخ اثنين من سلاسل مختلفة وظيفيا. تسلسل الحمض النووي الأول هو تفتيت محددة، ويسمح للالتضخيم من شظية باستخدام PCR. تسلسل الثاني يتداخل مع جزء المجاور، وهو أمر ضروري لGA التجمع. ومن شأن تسلسل الحمض النووي جزء معين نموذجي يكون 18-22 الإقليم الشمالي في الطول. يجب تسلسل الحمض النووي جزء محددة تستخدم لتضخيم DNA نفسه يكون درجات الحرارة ذوبان مماثلة والمحتوى GC. وينبغي أن يكون تسلسل متداخلة على الأقل من 15الإقليم الشمالي في الطول مع درجة حرارة انصهار لا يقل عن 48 ° C. سوف تجميع أكثر من 4 شظايا الحمض النووي تتطلب تسلسل تداخل أن تكون على الأقل 20 الإقليم الشمالي. سوف التداخل أطول تسمح خصوصية زيادة من الصلب مما أدى إلى شظايا الحمض النووي تجميعها أكثر بشكل صحيح. فمن المستحسن لتجنب متواليات التي تميل في GC أو AT المحتوى في تطوير متواليات متداخلة، لأن تسلسل منحرفة قد بخرق التجمع DNA الصحيح.
نقترح أيضا باستخدام كعنصر تحكم السلبية، التي لا ينبغي أن تنتج أي المستعمرات البكتيرية المقاومة للأدوية، مجرد جزء DNA الموافق العمود الفقري ناقلات في رد فعل GA. بدلا من ذلك، واحدة من شظايا الحمض النووي التي تضم "إدراج" قد حذفت من رد فعل GA، والتي ينبغي أن يؤدي أيضا إلى أي المستعمرات البكتيرية المقاومة للعقاقير. السبب لن تنمو المستعمرات سيكون عدم وجود نهايات متداخلة من شظايا الحمض النووي المجاورة، والتي سوف تجعل التجمع من مجمعات للبلازميد مؤسسة التدريب الأوروبية.
في وصف البروتوكول، وتداخل متواليات من 25 الإقليم الشمالي لتوليد استخدمت مجموعات التمهيدي، نظرا لوجود عدد من شظايا الحمض النووي المستخدمة (الشكل 3). على توصية من أداة موقع الجيل التمهيدي (انظر الجدول المعدات) هو استخدام لا يقل عن 20 متواليات متداخلة الإقليم الشمالي لتجميع 4-6 شظايا الحمض النووي. وبالإضافة إلى ذلك، يعد تداخل تسلسل وضمان تكامل السليم للحمض النووي (انظر الشكل 1) زيادة عدد المنتجات تجميعها بدقة.
حاليا، تتوفر عدة نظم لاستنساخ سلس. ومع ذلك، فإن بعض هذه النظم لا تزال تستخدم أنزيمات التقييد (أي، جولدن جيت استنساخ 18). ويستخدم آخرون يمزج الملكية من الانزيمات بناء على فيروس اللقاحية البلمرة DNA واحدة حبلا الحمض النووي ملزمة البروتين من نفس المصدر البيولوجي 19. كلا النظامين تقتصر بالمقارنة مع GA قبل شورطول ثالثا تداخل متواليات. لأن تسلسل متداخلة أقصر قد لا توفر خصوصية كافية لالخطوة الصلب من شظايا الحمض النووي المجاورة، مما يجعل التجمع السليم لأكثر من 23 شظايا الحمض النووي إشكالية. هذه العيوب ليست موجودة في نظام GA.
وينبغي النظر في حجم شظايا الحمض النووي ليتم تضخيمها أيضا حتى لا يتجاوز حجم amplifiable موثوق بواسطة PCR (أي أقل من 8 KBP في الطول). حتى مع تحسن في وظيفة بلمرة DNA في السنوات ال 10 الماضية، وسوف تتضخم شظايا الحمض النووي كبيرة مع أقل كفاءة ودقة. إذا لزم الأمر، يمكن الحصول على شظايا الحمض النووي أكبر من مصادر أخرى بديلة لPCR، على سبيل المثال، من خلال عزل البلازميد والهضم DNA المناسب مع الانزيمات قيود. على وجه التحديد، لبروتوكول موضح في مخطوطة الحالية، لدينا عقلانية لاستخدام PCR واستند على حجم شظايا الحمض النووي المتاحة، التي كانت كلها أقل من5 KBP. إذا كان هناك أكثر من منتج واحد PCR التي حددها الاغاروز الكهربائي للهلام، ويوصى هلام تنقية حجم جزء المرغوب فيه باستخدام أي من تقنيات البيولوجيا الجزيئية المتاحة أو مجموعات المناسبة. في البروتوكول الحالي يتم استخدام البلمرة DNA بالحرارة (انظر جدول المواد). لكن أي البلمرة DNA توفير الدقة العالية والعائد سوف تكون مناسبة ليتم استخدامها مع هذا البروتوكول. إذا عالية الدقة بلمرة DNA مختلفة من وصفها في البروتوكول متوفرة، استخدم إعداد الشروط كما هو موضح في كتيبات منها. في البروتوكول الحالي، E. المختصة كيميائيا وتستخدم خلايا القولونية التي يتم توفيرها مع عدة GA. بدلا من ذلك، الكهربائية المختصة كيميائيا أو E. سلالات القولونية مثل DH5α أو DH10B يمكن استخدامها.
الجمعية استنساخ مزيج الرئيسي 2X سهل الاستخدام مع الحد الأدنى من التدريب العملي في الوقت المحدد. ومع ذلك، مطلوب pipetting لدقيقة بسبب كميات صغيرة شمال شرقeded إلى أن تكون مختلطة معا. تحتاج جيدة تقنية البيولوجيا الجزيئية إلى أن تمارس في كل الأوقات أيضا.
استنساخ GA يوفر إمكانيات غير محدودة لبناء شظايا الحمض النووي، والبلازميدات وناقلات، والتي هي أطول من 3 KBP في الحجم. وبالإضافة إلى ذلك فإن لها تأثيرا أوسع في مجال البيولوجيا الاصطناعية، لأنه يسمح تركيب وتجميع، على سبيل المثال، البكتيري (الفطرانية الميكوبلازما) الجينوم بأكمله أو الخميرة (خميرة الخباز) كروموسوم 20،21. تقنية ينطبق أيضا على الاستنساخ التقليدية يحتاج لتوليد بنيات سلس.
وفي الختام، GA الاستنساخ يوفر بديلا سريعا وموثوقة ومرنة لإجراء استنساخ الحمض النووي التقليدي.
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر ميكايلا يانسن في مركز جامعة تكساس للتكنولوجيا العلوم الصحية، لوبوك، تكساس، وملادن Yovchev في جامعة بيتسبرغ المركز الطبي، بيتسبرغ، PA لتوفير بسخاء pcDNA 3.1 MYC-صاحب (A) وhEF1α المروج التي تحتوي على البلازميدات . وأيد البحوث ورد في هذه النشرة من قبل كينيدي شرايفر المعهد الوطني يونيس لصحة الطفل والتنمية البشرية من المعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة عدد R01HD037109 (لCCM). كان دعم إضافي من معهد لورا بوش لصحة المرأة (لCCM وPNG). المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification system |
Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix |
DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
NheI | New England BioLabs | R3131S | |
NotI | New England BioLabs | R3189S | |
HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |