质粒载体产生表达FLAG标记的蛋白质在人延伸因子1α启动子的使用吉布森大会规则
Summary
Synthesis of custom plasmids is labor and time consuming. This protocol describes the use of Gibson assembly cloning to reduce the work and duration of custom DNA cloning procedure. The protocol described also produces reliable tagged protein constructs for mammalian expression at similar cost to the traditional cut-and-paste DNA cloning.
Abstract
吉布森组件（GA）的克隆提供了一种快速，可靠和灵活的替代常规的DNA的克隆方法。我们使用遗传算法以创建定制的质粒的小鼠胚胎干细胞的外源基因（mESCs）的表达。的SV40或人巨细胞病毒启动子的控制下的外源基因表达转染到mESCs后迅速减弱。所述的治疗药本减弱表达是使用人延伸因子-1α（HEF1α）启动子来驱动基因表达。是包含HEF1α质粒载体没有被广泛作为SV40-或含CMV质粒，特别是那些还含有N-末端3XFLAG-标签。此处所描述的协议是一个快速的方法来创建的质粒表达FLAG标记CSTF-64和CSTF-64下HEF1α启动子的表现的调节突变。 GA使用的共混物的DNA外切核酸酶，DNA聚合酶和DNA连接酶，使重叠的可能的DNA片段的末端的克隆。基于模板的DNA，我们有可用的，我们设计了构建体被组装成一个单一的序列。我们的设计中使用的四种DNA片段：3.1的pCDNA载体骨架，HEF1α启动子部分1，HEF1α启动子部分2（其包含购买作为双链合成DNA片段3XFLAG标签），以及任一CSTF-64或特定CSTF-64突变体。这些片段的序列被上传到的引物生成工具设计适当的PCR引物，用于产生DNA片段。 PCR后的DNA片段混合用含有选择性标记和遗传克隆反应的载体装配。从个别转化的细菌菌落的质粒中分离得到。质粒的初始画面通过限制性消化完成，随后测序。总之，GA使我们能够在五天创建定制的质粒的基因表达，包括构建屏幕和验证。
Introduction
常规的DNA克隆方法依赖于使用限制性内切酶切割的DNA和DNA连接酶来连接DNA片段一起。含有不同DNA片段的定制表达构建体的产生是一个连续的过程，其中包括DNA的切割与一个和/或多个限制性内切酶和DNA片段通过连接的后续插入。这个过程的主要缺点是，合适的限制性酶对DNA片段中的一个可能是难以确定（ 即，可能有几个切割位点）描绘感兴趣不可能的全长蛋白质的成功的DNA克隆。因此，代定制表达下的有效的细胞类型特异性启动子的转录调控定制蛋白质标记构建需要非常仔细的设计。这也是一个时间和劳动消耗的技术。最近，几个报告中所述的方法来组装MULTIP在同时在任一个或两个步骤的反应的连续序列，而无需使用限制的文件不同的合成的DNA片段切酶1-3。一步法克隆反应（不包括所有的准备步骤），取决于所使用的混合DNA核酸外切酶，DNA聚合酶，DNA连接酶2,3和DNA片段的重叠末端（ 图1）的。由于没有使用限制酶的，任何尺寸和序列组合物（不包括高度重复序列）的DNA片段，可以稠合在一起以无缝结构。最近，一种商品试剂盒（吉布森组件;乔治亚州）用于一步法克隆反应变得可用。该套件可在定制发起人和蛋白质标记单个向量的任何DNA片段的快速，经济高效的装配。
用于表达在哺乳动物细胞培养物的模型的外源蛋白质的广泛使用的质粒表达载体下的转录章往往ulation病毒巨细胞病毒（CMV）或猿猴病毒40（SV40）启动子。这些病毒启动子提供一种在大多数的哺乳动物细胞培养的基础模型的外源蛋白质的健壮瞬时表达。然而，新一代的细胞系稳定表达外源蛋白质往往是因为CMV或SV40发起人的建立过程中4,5转录沉默不成功。此外，SV40和CMV病毒启动子将不会充分地促进外源蛋白质在细胞中来自淋巴谱系或胚胎干细胞6,7的表达。解决病毒启动子的固有限制是使用强组成的非病毒启动子8-10。人来源的一个良好表征强组成的非病毒启动子是延伸因子1α（HEF1α）启动子（HEF1α参与氨酰tRNA向核糖体11对GTP依赖关联的催化）。然而，是含有HEF1α启动子的表达载体不是作为广泛使用含有质粒的病毒启动子，特别是那些还含有3×FLAG在感兴趣的蛋白的氨基末端。
在64000兆瓦裂解刺激因子蛋白（CSTF-64）是参与大多数的mRNA 12,13，包括复制依赖性组蛋白的mRNA 14,15的3'端的处理。 CSTF-64表达在所有体组织12。其RNA识别基序结合的切割和聚腺苷酸化位点16的下游新生转录，GU富含RNA序列。此CSTF-64到前mRNA的结合促进了新生转录物的有效核酸内切裂解。
这里，一个协议描述了使用该DNA片段的PCR扩增，一个吉布森组件克隆试剂盒（其包括化学感受细菌细胞）以产生3XFLAG标记米定制载体乌斯CSTF-64或突变CSTF-64至HEF1α启动子1的表达在其氨基末端。
Protocol
Representative Results
Discussion
成功使用遗传克隆应当前始终有一个仔细设计的完整构建体（ 图2和图3）的。
由底漆生成工具设计引物序列的仔细核查，也极力推荐。在不使用的引物生成工具的可产生引物的GA。然而，使用该工具是高度推荐的，因为它简化了工艺。通常，引物对的GA克隆必须具有两个功能上不同的序列。第一序列是DNA片段特异性的，并且允许使用PCR片段的扩增。第二序列与相邻的片段，这是必要的GA组件重叠。一个典型的DNA片段的特异序列是长18-22个核苷酸。的DNA片段用于扩增相同的DNA特定序列必须具有相似的解链温度和GC含量。重叠序列应该至少为15核苷酸长度的至少48℃的熔化温度。大于4的DNA片段的装配将需要重叠序列为至少20个核苷酸。更长的重叠将使产生更正确组装的DNA片段退火的提高的特异性。建议避免被扭曲他们的GC或AT开发重叠序列的内容，因为倾斜的序列可能会损害DNA正确的装配序列。
我们也建议使用作为阴性对照，其不应该产生任何抗药性的细菌菌落，只对应于一个GA反应的载体骨架中的DNA片段。可替代地，包括了“插入”的DNA片段中的一个可从GA反应，这也应导致无抗药性的细菌菌落被删去。之所以没有菌落生长会缺少相邻DNA片段重叠的端部，这将呈现并发症的组装ETE质粒。
在协议中所描述的，重叠的，因为所用的DNA片段的数目（ 图3）的25个核苷酸序列来产生引物组使用。引物生成工具网站的建议（ 见表设备 ）是用至少20个核苷酸的重叠序列装配4 – 6的DNA片段。另外，更长的重叠序列可确保DNA链的适当互补（参见图1）增加的准确组装的产品数量。
目前，几个可用的系统无缝克隆。然而，这些系统仍然采用限制性内切酶（ 即金门克隆18）。其他人使用基于痘苗病毒DNA聚合酶和单链DNA结合蛋白来自相同生物源19的酶的专有共混物。这两个系统都是由肖尔相比限于GA重叠序列器长度。因为较短的重叠序列可能无法提供足够的特异性以相邻的DNA片段的退火工序中，使超过23的DNA片段有问题的正确装配。这些缺点是不存在于遗传系统。
的DNA片段被扩增的尺寸也应考虑以不超过该大小通过PCR（ 即，小于8千碱基长）可靠地扩增。即使在过去10年中的DNA聚合酶的功能的改进，大的DNA片段将用较少的效率和准确度被放大。如果需要的话，更大的DNA片段可能来自其他来源的替代PCR方法， 例如可以得到，由质粒分离和适当的DNA酶切。具体地讲，在当前的手稿中描述的协议，我们合理使用的PCR为基础的可用的DNA片段的大小，这比所有少5 KBP。如果有识别用琼脂糖凝胶电泳多个PCR产物，所希望的片段大小的凝胶纯化，使用任何可用的分子生物学技术或合适的试剂盒推荐的。在当前的协议的耐热性DNA聚合酶被用于（ 见表材料 ）。但是任何DNA聚合酶提供高保真和产量将是适合于本协议中使用。如果在协议说明以外的不同高保真DNA聚合酶是可用的，如在相应手册中所述使用设置的条件。在当前的协议，化学感受态大肠杆菌细胞被用于与该遗传试剂盒中提供。另外，化学或电主管E.大肠杆菌菌株，如DH5α或DH10B中都可以使用。
装配克隆2X预混液很容易用最少的动手时间使用。但是，准确的移液是NE，因为小体积的要求EDED并加以混合。良好的分子生物学技术，需要在所有的时间以及行使。
对GA克隆提供了无限的可能性的DNA片段，质粒和载体，这是超过3千碱基的大小的结构。此外，它在合成生物学领域的广泛影响，因为它允许合成和装配，例如，一个完整的细菌（ 丝状支原体 ）的基因组或酵母（酿酒酵母）的染色体20,21。该技术也适用于常规克隆需要生成无缝结构。
总之，GA克隆提供快速，可靠和灵活的替代传统的DNA克隆过程。
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢麦克拉扬森在得克萨斯理工大学健康科学中心，拉伯克，TX和Mladen Yovchev在美国匹兹堡大学医学中心，匹兹堡，宾夕法尼亚州的慷慨提供3.1的pCDNA MYC-他的（A）和HEF1α含子质粒。研报本出版物中由儿童健康和国立卫生研究院人类发展的尤尼斯·肯尼迪·施莱佛国立研究所在获奖数量R01HD037109（以CCM）的支持。额外的支持是从劳拉·布什研究所妇女健康（以CCM和PNG）。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Synthetic double-stranded DNA fragment (sDNA) | Integrated DNA Technologies | We used gBlocks, which can be up to 2 kb in length. However, there are many commercial sources of synthetic DNA available. | |
| DNA purification magnetic beads | Beckman Coulter | A63880 | Agencourt AMPure XP – PCR Purification system |
| Plasmid Isolation Mini Kit | Omega Bio-Tek Inc | D6942-01 | E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5510S | |
| DNA polymerase | New England BioLabs | M0494S | Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix |
| DpnI | New England BioLabs | R0176S | |
| NheI | New England BioLabs | R3131S | |
| NotI | New England BioLabs | R3189S | |
| HindIII | New England BioLabs | R3104S | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop device | |
| EditSeq | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| SeqBuilder | DNASTAR | Part of Lasergene Core Suite | |
| Word | Microsoft | Part of Microsoft Office | |
| NEBuilder | New England BioLabs | primer generation tool: http://nebuilder.neb.com | |
| NEBioCalculator | New England BioLabs | ligation calculator: http://nebiocalculator.neb.com/#!/ligation |
References
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