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생물학

A técnica de infiltração-centrifugação para Extração de apoplásticas Fluid das folhas da planta Usando<em> Phaseolus vulgaris</em> Como exemplo

Published: December 19, 2014
doi:
10.3791/52113
, , , ,
1Department of Plant Sciences,University of Oxford, 2School of Education of Vitoria-Gasteiz,University of the Basque Country (UPV/EHU), 3Biosciences,University of Exeter

Summary

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Abstract

O apoplasto é um compartimento extracelular distintos em tecidos de plantas, que se situa do lado de fora da membrana do plasma e inclui a parede da célula. O compartimento apoplástico das folhas da planta é o local de diversos processos biológicos importantes, incluindo a formação da parede celular, nutriente celular e absorção de água e de exportação, as interações planta-endofíticos e respostas de defesa para patógenos. O método de infiltração-centrifugação está bem estabelecida como uma técnica robusta para a análise da composição apoplasto solúvel de várias espécies de plantas. O fluido obtido por este método é comumente conhecido como fluido de lavagem apoplasto (FA). O protocolo a seguir descreve um método de infiltração a vácuo e centrifugação otimizado para extração de Phaseolus vulgaris AWF (Feijão) cv. Tendergreen folhas. São discutidas as limitações deste método e a otimização do protocolo para outras espécies de plantas. Recuperado AWF pode ser utilizado numa vasta gama de experimen jusantets que buscam caracterizar a composição do apoplast e como ela varia em resposta às espécies de plantas e genótipo, o desenvolvimento da planta e das condições ambientais, ou para determinar como os microrganismos crescem em apoplast fluido e responder às mudanças em sua composição.

Introduction

O apoplasto planta é o espaço intercelular, que circunda as células vegetais. Este é um ambiente dinâmico em que muitos processos metabólicos e de transporte ter lugar. O principal componente estrutural do apoplasto é a parede celular, que é montado e modificado por enzimas, proteínas estruturais e metabolitos localizados dentro do apoplasto. Nas células vegetais saudáveis ​​apoplasto é geralmente mantida em um estado de acidez permitindo aminoácidos, açúcares e outros nutrientes a ser importado a partir do apoplasto para o citoplasma por H + symport 1. Durante o transporte de sacarose, move-se a partir de fontes de sacarose através do apoplasto fotossintéticas e na vasculatura floema; sacarose é, então, transportado por um potencial osmótico mantido por invertases apoplásticas clivagem sacarose nos órgãos pia 2. Açúcares e outros nutrientes pode também ser transportada para cima e acumulam-se em cavidades estomática transpiração através da corrente 3.

"> O apoplast também representa um nicho ecológico onde muitos patógenos estabelecer seu estilo de vida parasitária. Fitopatógenos bacterianas têm a capacidade de se multiplicar para altas densidades no apoplasto, o que eles acessam através de aberturas naturais, como estômatos ou através de feridas 4. A concentração de amino ácidos e outros compostos nitrogenados em tomate apoplast foram mostrados para ser suficiente para suportar as necessidades nutricionais de bactérias e fungos patogénicos 5,6. respostas de defesa primárias, para patógenos microbianos também ocorrem no apoplasto, ou seja, a produção de espécies reativas de oxigênio por peroxidases extracelulares . e oxidases e o fortalecimento da parede celular através de cross-linking e calejado deposição 7 A parede celular da planta é rica em metabólitos secundários com atividades anti-microbianas, a natureza bioquímica destes metabólitos secundários varia entre as espécies 8.

Como resultado do acima-mençãoed e outros processos, folha fluido apoplástico contém uma variedade de proteínas, açúcares, ácidos orgânicos, aminoácidos, metabolitos secundários, metais e outros catiões (por exemplo, Mg 2+, K +, Na +, Ca 2+, Fe 2/3 +). As concentrações de soluto no apoplasto dos ramos são amplamente controlada pelo equilíbrio dos processos de transporte que ocorrem entre o apoplasto e o xilema, floema e citoplasma 9. No entanto, as reações metabólicas e crescimento microbiano também consumir ou produzir solutos apoplásticas. A composição da apoplast é conhecido por ser diferente entre as espécies de plantas e de genótipos e em resposta às mudanças nas condições ambientais, incluindo a luz, nutrição e estresses bióticos e abióticos 9. Ao estudar a composição do apoplasto e como ela muda, incluindo propriedades, tais como redox e potencial osmótico, pH, nutrientes / metabolito disponibilidade e actividades enzimáticas, pode-se obter novas perspectivas sobre as plantas como rerespondem ao seu meio ambiente. Compreensão ou caracterizar as alterações moleculares que ocorrem na solução apoplasto é complicado porque é um compartimento espacialmente estruturado e dinâmico em que os metabolitos e / ou iões podem ser voláteis, transiente ou associada com a parede celular e membrana de plasma. Além disso, são necessárias diversas técnicas analíticas para cobrir a gama de diferentes tipos de produtos químicos.

Para estudar a composição do apoplasto solúvel, o fluido geralmente precisa ser extraído do tecido. Existem vários métodos para extrair apoplasto fluido a partir de vários tecidos, incluindo um novo método proposto tira de filtro 10, mas o método de extracção de folhas mais aceite para a infiltração-centrifugação. Esta técnica tem sido avaliado previamente 11-13 e Lohaus et al. 2001 14 fornecer uma análise aprofundada de muitos dos parâmetros técnicos do método. Como o próprio nome, a infiltração-centrifugação técnica é um método de dois passos que envolve essencialmente a substituição do espaço de ar apoplástico com uma infiltração de fluido aquoso, que se mistura com o fluido apoplástico nativa, seguido por recuperação da infiltração / mistura fluida apoplástico por centrifugação suave das folhas. À medida que o fluido recuperado é diluída e não contém todos os compostos presentes no apoplasto (ver abaixo), este fluido é geralmente conhecido como apoplasto fluido de lavagem (FA), ou líquido de lavagem, por vezes intercelular, em vez de fluido apoplástico. A técnica de infiltração-centrifugação é facilmente escaláveis ​​que permite que amostras individuais ou agrupados AWF de volume adequado para ser gerado e submetido a uma ampla gama de técnicas bioquímicas e análise a jusante (por exemplo, electroforese de proteínas, medição da actividade enzimática, RMN, diversos tipos de cromatografia e de massa espectrometria). Folha AWF também é útil como um meio de crescimento que imita apoplasto para estudar a interacção de planta colonizar micróbios with seu ambiente 5.

Nos seguintes protocolos que descrevem como executar a técnica de infiltração-centrifugação usando Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen folhas, e fornecer alguns exemplos de análises a jusante com foco em metabolômica. É importante ressaltar que os métodos para avaliar a qualidade da AWF são fornecidos junto com o conselho para otimizar o procedimento para os diferentes tipos de folhas.

Protocol

NOTA: A escolha do material de partida folha e padronização das condições de crescimento da planta é fundamental uma vez que estes fatores podem afetar muito a qualidade, a variabilidade e rendimento da AWF (Figura 1). Os parâmetros a considerar são mostrados na Tabela 1 e são discutidos em mais pormenor na discussão. Parâmetro Exemplo padronizações Phaseolus vulgaris Solanum lycopersicum Arabidopsis thaliana Tipo Folha Primeiras folhas verdadeiras totalmente expandidas, saudável 2 º e 3 º folhas a partir de baixo, 4 maiores folhetos tomadas folheto apical não utilizados para extração apoplast Roseta folhas completamente expandidas Idade da planta 21 dias 7-9 weeks </td> 7 semanas Hora do dia Médio do período de luz (12:00) Médio do período de luz (12:00) Médio do período de luz (12:00) Hidratação Todas as plantas bem regada 1 hr de pré-colheita Todas as plantas bem regada 1 hr de pré-colheita Todas as plantas bem regada 1 hr de pré-colheita Luz Luz 16 horas, 400 mmol m -2 s -1 Luz 16 horas, 400 mmol m -2 s -1 10 h de luz (dia short) a partir da semana 2, 400 mol m -2 s -1 Umidade 70% 70% 70% Temperatura 22 ° C luz, 18 ° C escuro 22 ° C luz, 18 ° C escuro 21 ° C Tabela 1. Exemplos de parâme padronizadoters de folhas usadas em extrações AWF. 1. Generating apoplast lavar Fluid NOTA: Durante este materila perigosos protocolo inculding patógenos microbianos das folhas infectadas não devem ser lavados pelo ralo; procedimentos, em vez de descarte deve ser usado. Escolha aparelhos com base no tamanho da folha: Se infiltrar folhas menores (por exemplo, de Arabidopsis, feijão), utilizando uma seringa sem agulha. Use um frasco de vácuo para se infiltrar em folhas que são muito grandes para caber em uma seringa. Use o método de balão de vácuo para se infiltrar em várias folhas simultaneamente. Divide folhas que são demasiado grandes para o método de infiltração disponível em secções mais pequenas utilizando uma lâmina de barbear. Seções foliares Lave bem cortadas em água destilada antes da infiltração para remover contaminantes citoplasmáticos que exalam a partir de células danificadas. Infiltração da folha usando uma seringa de 60 ml: Retire a folha a partir doplanta no pecíolo com uma lâmina de barbear. Para folhas compostas, tais como tomate, retire os folhetos no peciólulo. Lavar a folha recém excisado por submersão em água destilada para remover os contaminantes da superfície da folha. Seque a folha borrando suavemente com papel absorvente ou papel. Medir o peso das folhas antes de infiltração. Enrole cuidadosamente e / ou dobrar a folha em uma seringa de 60 ml e encher a seringa com água destilada (outros fluidos de infiltração pode ser utilizada, ver discussão). Ejetar o ar dentro da seringa, baixando o êmbolo até aproximadamente à marca de 40 ml. Cubra a ponta da seringa ou com um dedo de luva ou um pedaço de Parafilm, em seguida, criar uma pressão negativa no interior da seringa puxando o êmbolo para fora, para a marca de 60 ml. Solte lentamente o êmbolo. NOTA: libertando rapidamente a pressão pode resultar na lise celular e contaminação citoplasmática. Desligue a ponta da seringa e ejetar o ar, então ligar a ponta e pressionemais para baixo sobre o êmbolo para criar uma quantidade modesta de pressão positiva. Repita os passos 1.2.5 – 1.2.6 até que a folha está completamente infiltrado, como pode ser visto pela cor escurecida das áreas infiltradas. Remover a folha a partir da seringa. Suave mas completamente apagar a folha com papel absorvente para remover o líquido da superfície. Medir o peso da folha infiltrada. Calcula-se a diferença em peso antes e depois da infiltração, que se aproxima intimamente do volume infiltração. Infiltração Folha por balão de vácuo: Retire a folha da planta no pecíolo usando uma lâmina de barbear. Lavar a folha recém excisado por submersão em água destilada para remover os contaminantes da superfície da folha. Seque a folha borrando suavemente com papel absorvente. Medir o peso das folhas antes de infiltração. Coloque a folha (ou folhas se infiltrando folhas múltiplas) em 250 ml de um lado maior ou co balão braçontaining água destilada (outros fluidos de infiltração pode ser usado, consulte Discussão). Totalmente cobrir as folhas com o líquido. Aplicar um vácuo ao balão. Agite suavemente para soltar as bolhas de ar a partir das folhas. Cuidadosa e lentamente libertar o vácuo. NOTA: libertando rapidamente o vácuo pode resultar na lise celular e contaminação citoplasmática. Repetir o passo 1.3.5, até a folha está completamente infiltrado, como pode ser visto pela cor escurecida das áreas infiltradas. Remover a folha do balão. Suave mas completamente apagar a folha com papel absorvente para remover o líquido da superfície. Medir o peso da folha infiltrada. Calcula-se a diferença em peso antes e depois da infiltração, que se aproxima intimamente do volume infiltração. Recuperação de AWF por centrifugação: Coloque a folha sobre um pedaço de 4 polegadas (10 cm) de largura Parafilm. Utilizando uma ponta de pipeta de 5 ml (ou um objeto de tamanho similar),arregaçar a folha dentro do Parafilm. Insira a folha enrolado com ponteira em uma seringa de 20 ml. Posicione todas as bordas da folha de corte para cima. Insira a seringa em um tubo de polietileno ou policarbonato 50 ml limpo. Centrifuga-se o interior do tubo de seringa durante 10 min a 1000 xg num rotor basculante a 4 ° C. NOTA: O exame visual das folhas seguintes centrifugação deve revelar que a maioria do fluido infiltração foi expulso. Escuras manchas verdes indicam que é necessário tempo de centrifugação adicional. Pipeta a AWF recuperado em novos tubos de 1,5 ml. NOTA: O volume de AWF deve corresponder aproximadamente o volume de infiltração para que folha; se o volume é menor que o tempo de centrifugação adicional ou a velocidade de centrifugação é necessária. Centrifuga-se as amostras a 15.000 xg AWF durante 5 min para eliminar quaisquer células ou partículas. Alternativamente, passam a AWF através de um filtro de 0,22 um para remove células e material particulado. Pipeta-se o sobrenadante para um novo tubo. Manter as amostras em gelo até o armazenamento. Armazenar as amostras AWF a -80 ° C. 2. Ensaios para citoplasmática Contaminação Manter as amostras AWF em gelo para minimizar reacções enzimáticas (por exemplo, de proteólise) e realizar os ensaios imediatamente após os passos de centrifugação são completa. NOTA: Para os ensaios de metabolitos, as amostras podem ser congeladas imediatamente depois da extracção e armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Para um malato desidrogenase standard (MDH) protocolo de ensaio ver 15; caso contrário, use um kit de ensaio MDH disponíveis comercialmente. Para um padrão desidrogenase glicose-6-fosfato (G6PDH) ver protocolo de ensaio 16; caso contrário, utilizar um kit de ensaio comercialmente disponível de G6PDH. Para a quantificação dos metabolitos citoplasmáticos tais como glucose-6-fosfato (G-6-P) usar GC-MS tal como descrito no passo 5 </strong>. Caso contrário, utilizar um kit disponível comercialmente para o ensaio directo de G-6-P. 3. Cálculo do Factor de Diluição apoplasto Preparar dois volumes do fluido de infiltração acima utilizado no passo 1.2.4 ou 1.3.4 (por exemplo, água destilada). Adicionar pó de carmim de indigo a uma solução a uma concentração final de 50 | iM, não acrescentam nada ao outro. Medir a absorvância a 610 nm (OD 610) de 200 ul da solução de infiltração de carmim de indigo com um leitor de placas. Corrija esse valor, subtraindo o OD 610 de 200 ml de solução de infiltração sem indigocarmina. Substitua este valor corrigido como OD 610infiltrate na equação abaixo. Realizar pelo menos três infiltrações folha replicado como acima (passo 1.2 ou 1.3), com ambas as soluções de infiltração (com e sem indigocarmina). Após a infiltração, rinse as folhas em água destilada para remover qualquer remanescente de carmim de indigo presentes nas superfícies exteriores. Prossiga com centrifugação como acima (passo 1.4). Determine o OD média 610 de 200 mL da extrações AWF indigo carmim. Corrija esse valor, subtraindo o valor médio OD 610 de 200 mL de indigocarmina livre AWF. Substitua este valor corrigido como OD 610AWF na equação abaixo. Calcular o fator de diluição (ou seja, dobrar diluição) a partir dos valores de absorção corrigidas como: Apoplast fator de diluição = OD 610infiltrate / (610infiltrate OD – OD 610AWF) Concentração ou atividade Multiplique os valores de AWF pelo fator de diluição para estimar a concentração / atividade no fluido apoplástico in planta. 4. Concentração de AWF a força completa por liofilização Ligue o congelamento de cabelo e umGUARDE para estabilizar na temperatura e pressão de trabalho. Piscina a quantidade desejada de amostras AWF frescos ou armazenados. Distribua as amostras uniformemente entre dois tubos de centrífuga ml. Determinar o volume de reconstituição: Volume de reconstituição = volume antes de fator de diluição de liofilização / apoplast Com as tampas fechadas, congelar os tubos em azoto líquido. Transferir os tubos congelados para uma ou mais refrigerados vasos de secagem por congelação. Durante a transferência dos tubos, recoloque a tampa com um que foi perfurado com um objeto pontiagudo para permitir a troca de gás. Prenda os navios para o congelamento de cabelo e liofilizar as amostras completamente. Retirar amostras da máquina e reconstituir o AWF por adição da quantidade calculada de água destilada. Substituir a tampa não perfurada e armazenar as amostras a -80 ° C. 5. Metabolite Análise por cromatografia gasosa Mass Spectrometry 17 <ol> Pipetar 200 l de AWF para um tubo de 1,5 ml Adicionar 700 ul de metanol contendo 10 ug / ml ribitol como um padrão interno. Aquece-se a 70 ° C durante 10 min. Centrifugar durante 10 minutos a 11.000 x g. Transferir 700 uL de sobrenadante para um novo tubo de 1,5 ml. Adicionar 375 mL de clorofórmio frio e vortex por 10 s. Adicionar 500 uL de dH2O e vortex durante 10 seg. Centrifugar durante 15 minutos a 2200 x g. Transferir 150 ul da camada aquosa superior num novo tubo de 1,5 mL, em seguida, secar as amostras completamente num concentrador de vácuo sem calor. Dissolve-se as amostras em 30 uL de piridina contendo 20 mg / ml de cloridrato de metoxiamina. Incubar a 70 ° C, agitando vigorosamente durante 2 hr. Adicionar 50 ul de MSTFA (N-metil-N- (trimetilsilil) trifluoroacetamida). Incubar a 37 ° C enquanto agitando durante 30 min. Amostras de transferência da GC-MS compfrascos de vidro atible. Realizar a análise de GC-MS das amostras. Consulte Lisec et al. 2009 17, para obter detalhes sobre GC-MS configuração e desempenho do equipamento.

Representative Results

Os resultados típicos para extracções realizadas em AWF healthy 3 semanas de idade de P. vulgaris cv. Tendergreen folhas, utilizando água destilada como fluido de infiltração estão apresentados na Tabela 2. Jovem P. vulgaris folhas são passíveis de infiltração, e a velocidade de centrifugação utilizado aqui (1000 xg) a remoção da maioria de infiltração de fluido por centrifugação pode ser visto directamente que as folhas de reverter para a sua cor original verde. P. vulgaris folha de matéria fresca foi em média de 1,1 xg antes da infiltração e rendeu 0,5 ml de AWF por grama de peso fresco. A concentração de proteína da AWF foi determinada como sendo de 0,18 ± 0,08 mg / ml usando um ensaio de proteína de Bradford padrão. O fator de diluição para estas folhas, calculado através da medição de diluição indigo carmim, foi de 2,3 ± 0,3 vezes. Os valores acima podem variar substancialmente entre as espécies e experiências-piloto são necessários para determinar o rendimento de AWF por grama de folha fresca nósight, bem como a concentração de proteína AWF e factor de diluição que pode ser esperado para um dado tipo de folha. Danos para a integridade das células pode ocorrer tanto durante a fase de infiltração, se as alterações na pressão são demasiado rápida, e durante o passo de centrifugação, se a força centrífuga é demasiado elevada. Por conseguinte, é necessário utilizar amostras AWF para marcadores de contaminação citoplasmática; idealmente, múltiplos ensaios independentes são realizados. Aqui, os resultados de três ensaios possíveis são relatados na Tabela 2. Na extracções correctamente realizados de P. vulgaris AWF, G6PDH foi indetectável por um ensaio enzima padrão. Isto é consistente com outros relatórios onde a atividade G6PDH torna-se detectável apenas acima de um limite a força centrífuga 12. Em contraste, um nível basal de actividade de desidrogenase de malato (2,5 U / ml) foi detectável em todos P. amostras vulgaris AWF utilizando um ensaio metabólico padrão. O aumento da centrífuga parace acima de um limite de 1.000 xg resultou em aumento das actividades de MDH (resultados não mostrados). Como o apoplasto partir de outras espécies é conhecido por conter actividade endógena MDH 18, a quantidade detectada aqui é considerada verdadeira actividade apoplástico e aumentos significativos acima deste nível de linha de base são indicativos de contaminação. Os metabolitos que se acredita serem predominantemente citoplasmática, tal como hexose-6-fosfato, também podem ser utilizados para avaliar a contaminação de AWF. Aqui, a análise de GC-MS detectado zero ou traço níveis de G-6-P em extrações AWF. Em contrapartida, nas secções de raiz de milho corte, G-6-P foi detectada após a extracção AWF em todas as velocidades de centrifugação e aumento na concentração a velocidades mais elevadas, indicando contaminação citoplasmática 10. Análise de metabolitos por GC-MS de P. vulgaris folha AWF produz tipicamente 40-60 metabolitos identificáveis ​​e um número aproximadamente igual de compostos não identificáveis ​​(Figura 2). Ougânica ácidos, açúcares simples, e aminoácidos representam a maior parte dos metabolitos identificáveis, no entanto, os metabólitos secundários de plantas também foram detectados e quantificados a partir AWF 11. Vários exemplos de picos destas classes de moléculas diferentes são marcados na Figura 2 Outras técnicas analíticas a jusante são aplicáveis ​​para estas amostras AWF para quantificar várias moléculas, por exemplo:. ICP-MS, RMN, HPLC, espectroscopia de absorção atómica, espectrometria de massa de proteína. O componente proteico do apoplasto é também representada na AWF como mostrado na Brilliant Blue gel corado com Coomassie de SDS-PAGE na Figura 3. Entre outras funções, as enzimas apoplásticas são responsáveis ​​pela síntese da parede celular e a criação de extracelular reactiva espécies de oxigênio. Estudos de proteómica AWF de várias espécies identificadas dezenas de proteínas individuais e mostraram que o componente proteico do apoplasto responde a Enviroestresse nmental 13,19. Idealmente extrato AWF deve estar livre de contaminação por proteínas citoplasmáticas como Rubisco; no entanto, na prática isso é difícil de alcançar. A presença de uma banda de proteína de Rubisco em ~ 53 kDa por SDS-PAGE a seguir proporciona um outro ensaio qualitativo para a integridade de amostras AWF. Por exemplo, a amostra carregada na pista 2 na Figura 3 contém uma maior quantidade de contaminação de Rubisco de que a pista 1. Phaseolus vulgaris AWF Volume de AWF (ml g -1 folha FW) 0,49 ± 0,09 Conc proteína. (Mg ml-1) 0,18 ± 0,08 Factor de diluição 2,3 ± 0,3 Actividade de G6PDH (U ml-1) <td> Não detectada Glc-6-P (mg ml-1) não detectada MDH actividade (U ml-1) 2,5 ± 0,9 Tabela 2. Os resultados típicos para extrações AWF de P. vulgaris cv. Tendergreen folhas. Figura 1. fluxo de trabalho de extração apoplast padrão. Os números referem-se passos no protocolo. Figura 2. Um exemplo GC-MS cromatograma da P. Vulgaris cv. . Tendergreen AWF Os picos exemplo metabolito numerados são os seguintes: 1-malonato, 2-fosfato, succinato de 3, 4-desconhecido, 5-malato, 6-asparagina, 7-ribitol (r internoAndard), 8-citrato, 9-glucose, 10-inositol, ácido cafeico-11, 12-sacarose. Figura 3. Um exemplo de SDS-PAGE corado com Coomassie de gel de P. Vulgaris extractos de folha AWF. Este gel proporciona uma comparação entre os componentes da proteína de duas extracções AWF que diferem na quantidade de contaminação citoplasmática abundante pela enzima plastidial de Rubisco. Após a extracção AWF ambas as amostras foram submetidas a precipitação da proteína de acetona em um excesso de 4 vezes (v / v) de acetona fria e ressolubilizado em água a um décimo do volume original. As pistas 1 e 2 contêm 40 ug de proteína. A banda correspondente à cadeia de Rubisco grande (~ 53 kDa) está indicada por uma seta. R M: marcadores de peso molecular de proteínas.

Discussion

Otimizando a fonte de tecidos de plantas

A variação biológica e técnica pode ser grande ao realizar extracções apoplasto, assim, um fluxo de trabalho altamente padronizada é útil para aumentar a continuidade entre experiências (Figura 1). É importante notar que a fonte do tecido da planta tem de ser normalizado, incluindo o tipo de folha, a idade da folha, crescimento / condições ambientais e o tempo de dia (Tabela 1). Existem grandes diferenças na facilidade com que as diferentes folhas são infiltradas e o AWF subsequentemente recuperado por centrifugação; essas diferenças estão relacionadas com o número de estômatos, o tamanho da abertura e resistência mesophyll 12,14. Mesmo entre os diferentes cultivares de feijoeiro há grandes diferenças na facilidade e rendimento do processo de extracção AWF; por exemplo, as folhas da variedade Tendergreen usados ​​aqui são mais passíveis de extração AWF usando esse método do que a cultivar Maravilha canadense. DentroP. vulgaris as primeiras folhas verdadeiras são o maior e mais fácil de se infiltrar, tornando-as a escolha óbvia para extrações apoplásticas. O volume de ar e água apoplástico foi mostrado para variar com a idade da folha em várias espécies que conduzem a diferenças na AWF extractabilidade 12,14. Em P. vulgaris, folhas mais velhas tornam-se substancialmente mais difícil de se infiltrar e rendem menos AWF sob centrifugação; Por conseguinte, as folhas foram recolhidas quando atingiram plena expansão. As folhas que são difíceis de se infiltrar, subsequentemente, exigem velocidades mais elevadas de centrifugação para recuperar a AWF. Deve-se, portanto, cuidadosamente tela vários tipos de folhas diferentes e variedades antes de decidir sobre uma fonte de tecido para extrações AWF grande escala.

Condições de crescimento das plantas também devem ser normalizados, tanto quanto possível, dentro do contexto do experimento. O uso de câmaras de crescimento é preferível, pois permitem que a umidade constante, temperatura e lighregimentos intensidade t de ser mantidas. A colheita de folhas devem sempre ocorrer na mesma altura do dia porque as concentrações de metabolitos, enzimas, etc., variam durante o ciclo diurno 14. Finalmente, para assegurar que a unidade deixa todos têm a pressão de turgescência semelhante, as plantas devem ser regadas logo antes (~ 1 hora) a colheita.

Optimização da infiltração e centrifugação folha

Citoplasmática contaminação indesejável da AWF devido à lise celular parcial resultará se a tensão mecânica encontrada pelas células é demasiado alta durante as etapas de infiltração ou centrifugação. Portanto, o procedimento para um determinado tipo de folha deve ser um trade-off entre a maximização do rendimento otimizado e minimizando a contaminação citoplasmática da AWF. Em todos os casos, deve usar-se a mais baixa velocidade de centrifugação a AWF que pode ser recuperada para evitar a possível ruptura mecânica das células da folha. Otimização do centrifugação velocidade deve ser determinada empiricamente para cada tipo de folha através da monitorização do volume recuperado e apoplasto contaminação ao longo de um intervalo de velocidades de centrifugação. Tem-se observado que as actividades da enzima marcador, tal como o MDH, G6PDH e isomerase de glucose-fosfato, permanecerá baixo até que uma força centrífuga limiar é ultrapassado, acima do qual estas actividades aumentar rapidamente, presumivelmente devido a fugas citoplasmática 9,12,14. A utilização de Parafilm para apoio durante o passo de centrifugação, como foi observado por Baker et al., 2012 11, pode melhorar a eficácia da extracção e podem AWF minimizar os danos mecânicos à lâmina foliar causada pela dobragem e compressão excessiva. Além disso, o uso de Parafilm melhora a visualização da folha após a centrifugação quando se deve examinar a folha de danos e completude da extração AWF.

Nouchi 12 descrevem a otimização da recuperação AWF de seções de folhas de arroz corte, que são difficult para se infiltrar e exigem velocidades mais altas de centrifugação para recolher AWF por causa de suas pequenas aberturas estomáticas. Melhoria da molhagem da superfície da folha do arroz, quer por pré-embebição das folhas em água destilada ou a adição de um agente tensioactivo ao fluido de infiltração, facilitado o processo de infiltração. A velocidade de centrifugação superior (6.000 xg) também foi utilizado durante o monitoramento de contaminação apoplástico 12. Ao usar seções foliares corte há sempre o risco de que a contaminação citoplasmática será mais prevalente, mesmo com lavagem exaustiva dos locais das feridas; folhas cortadas deve, portanto, ser utilizado apenas quando necessário.

Para muitos estudos água destilada é utilizada como fluido de infiltração 11. No entanto, os compostos podem ser adicionados ao fluido de infiltração, tal como sais ou tampões, para melhorar a extracção de certos compostos apoplásticas 13, especialmente proteínas. Lohaus 14 avaliaram o efeito da força iônica e osmótica on a composição da AWF recuperado e encontrou-os a ser insignificante. As alterações no pH do meio de infiltração, no entanto, pode afectar a composição AWF 14.

Manuseamento e armazenagem do fluido apoplástico extraído é importante. AWF demonstrou conter uma grande quantidade de proteases e outras enzimas 13,20, bem como compostos orgânicos voláteis. Portanto, para reduzir a alteração da composição da AWF após a recuperação, recomenda-se manter as amostras em gelo ou de outro modo armazenado a -80 ° C. Além disso, ensaios enzimáticos de AWF deve ser realizada o mais rapidamente possível após a extracção para limitar a inactivação da enzima devido à proteólise, diluição prolongada ou congelar-descongelar.

O processo de infiltração dilui o fluido apoplástico e é frequentemente necessário determinar a extensão desta diluição. A etapa de centrifugação também pode diluir a AWF com água de compartimentos intracelulares. Um fator de diluição é precisoed para estimar in vivo apoplast concentrações químicas quando as medições são feitas em AWF. Um fator de diluição também é necessário para concentrar AWF volta com força total quando ele está sendo usado como um apoplast imitando meio de crescimento para os micróbios – combinando, assim, das concentrações dos metabólitos vivo com a maior precisão possível. Diversas variações existir no método descrito no passo 4 para a determinação do factor de diluição AWF medindo a diluição de um composto marcador adicionado ao fluido de infiltração. Para todos os métodos de cálculo de diluição AWF assume que o fluido que a infiltração não é apreciavelmente absorvidas ou diluído por as células da folha durante o processo de recuperação AWF. Esta hipótese tem sido verificada anteriormente para a fase de infiltração 14, mas é não verificado para a etapa de centrifugação. O composto marcador também não deve ser absorvido, transportado ou modificado enquanto no apoplasto. Indigo carmim é o mais utilizado e testado completamente de corantes usadospara cálculos de diluição AWF. Indigocarmina exibe uma baixa absorção de resina de troca catiônica e paredes celulares isoladas e mostrou-se adequado para cálculos AWF em Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum e Glycine max 11,21,22. No entanto, em alguns tipos de folhas, por exemplo, arroz e pepino, indigocarmina parecia não estar totalmente recuperado após a infiltração, o que levaria a uma subestimação do factor de diluição AWF 12,21. A falta de recuperação de indigocarmina pode ser devido à sua susceptibilidade à clivagem em sulfonato de isatina de superóxido por 23, que é conhecido por ser produzido no apoplasto, especialmente sob tensão 24. A clivagem de indigotina em sulfonato de isatina irá resultar numa perda de absorvância a 610 nm e um aumento em 245 nm. Se esta reacção ocorre de forma apreciável no apoplasto, ou se esta reacção pode ser inibida pela adição de agentes de limpeza de superóxidos, infiltratfluido ion não foi investigado até o momento. Dextrano azul foi usado em vez de carmim de indigo para quantificação do factor de diluição AWF em arroz folhas 12, embora a sua estabilidade e de recuperação da AWF não foi relatada. Alternativamente, os compostos radiomarcados tais como [14 C] de sorbitol ou outros padrões internos quantificáveis ​​pode ser usado em vez de corantes e a diminuição da radioactividade ou concentração medida e usada para calcular o factor de diluição, de um modo análogo 11,14,25.

Limitações da técnica

Existem algumas ressalvas para o método de isolamento AWF infiltração-centrifugação. Em primeiro lugar, a diluição do apoplasto durante a infiltração pode provocar uma resposta a partir da planta. Se as células vizinhas folha detectar uma concentração diminuída para certos componentes do fluido apoplástico, eles podem responder excretando Outros metabolitos, distorcendo a interpretação de concentrações do metabolito. Emuma avaliação deste problema foi observado que nem o tempo entre a infiltração e centrifugação nem diferenças moderadas na força iónica do líquido infiltração afectou a composição do AWF extraída 14,22. Portanto, quaisquer artefatos decorrentes da diluição apoplast são pensados ​​para ser mínima.

Uma segunda desvantagem é que o potencial de eluição de AWF por centrifugação não capturar todas as moléculas presentes no apoplasto por várias razões. Alguns compostos, em particular os catiões e as proteínas podem ser firmemente associada com a parede celular carregada negativamente e não eluir com a AWF 13. Outras moléculas, tais como as proteínas podem ser muito grandes para eluir eficientemente para fora do apoplasto para as velocidades de centrifugação utilizados 14. Espécies reactivas de oxigénio são uma importante classe de composto produzido no apoplasto, mas, devido à natureza de curta duração destes compostos, e não especificadas requisitos para a sua produção, sua presence não é bem capturado por extracção AWF. Não se sabe como AWF representa com precisão a composição in vivo do fluido apoplasto e pode variar entre espécies.

Existem vários ensaios para determinar a contaminação citoplasmática, embora nenhum são universalmente aceites. Ensaios de enzimas predominantemente citoplasmáticos (por exemplo, G6PDH, fosfato isomerase hexose, MDH) tem a vantagem de ser de fácil execução, mas pode não se correlacionam bem com vazamento citoplasmática 14,18. A avaliação dos metabólitos citoplasmáticos (por exemplo, fosfatos de hexoses, clorofila) é talvez mais indicativa, mas não está tão bem estabelecida 11. No entanto, um ou outro tipo de ensaio pode ser útil para a quantificação relativa de contaminação apoplástico entre amostras. Idealmente, várias medições independentes devem ser utilizados para validar a integridade da amostra AWF.

Embora reconhecendo as suas limitações, a infiltração-centrifugatina técnica descrita aqui permanece uma técnica simples e robusta no estudo de proteínas apoplásticas, metabólitos primários e secundários e iões inorgânicos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Eppendorf Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22364111
razor blade Fisher 12-640 
60 ml syringe Becton Dickinson 300865
20 ml syringe Becton Dickinson 300613
4 inch parafilm Bemis PM-996
side arm flask SciLabware 12972831
vacuum source
5 ml pipette tips Fisher 50-813-28 
centrifuge Beckman Coulter 392932
Swinging bucket rotor Beckman Coulter 369702
indigo carmine Sigma I8130
microplate reader Tecan Infinite 200
96 well plates Becton Dickinson 353072
freeze dryer SciQuip Christ Alpha 2-4 LD
microcentrifuge biorad 166-0612EDU
oxaloacetic acid Sigma O4126
D-glucose-6-phosphate Sigma G7250
NADH Roche 10128023001
MDH assay kit Biovision K654-100
G6PDH assay kit Sigma MAK015-1KT
G-6-P assay kit Biovision K657-100
ribitol Sigma A5502
methanol Sigma 650471
chloroform Sigma 472476
vacuum concentrator Thermor Scientific SC250EXP
methoxyamine hydrochloride Sigma 226904
N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide Sigma 394866
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References

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O’Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example. J. Vis. Exp. (94), e52113, doi:10.3791/52113 (2014).
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