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생물학

La técnica de infiltración-centrifugación para extracción de apoplástico fluido procedente de hojas de la planta Uso<em> Phaseolus vulgaris</em> Como ejemplo

Published: December 19, 2014
doi:
10.3791/52113
, , , ,
1Department of Plant Sciences,University of Oxford, 2School of Education of Vitoria-Gasteiz,University of the Basque Country (UPV/EHU), 3Biosciences,University of Exeter

Summary

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Abstract

El apoplasto es un compartimento extracelular distinta en los tejidos de la planta que se encuentra fuera de la membrana plasmática y la pared celular incluye. El compartimiento apoplástico de hojas de la planta es el sitio de varios procesos biológicos importantes, incluyendo la formación de la pared celular, nutriente celular y la absorción de agua y de las exportaciones, las interacciones planta-endófitos y respuestas de defensa frente a patógenos. El método de infiltración-centrifugación está bien establecida como una técnica robusta para el análisis de la composición apoplasto soluble de varias especies de plantas. El fluido obtenido por este método se conoce comúnmente como apoplasto fluido de lavado (AWF). El siguiente protocolo describe un método de infiltración de vacío y centrifugación optimizada para la extracción de Phaseolus vulgaris AWF (habichuela) cv. Tendergreen hojas. Se discuten las limitaciones de este método y la optimización del protocolo para otras especies de plantas. AWF recuperado se puede utilizar en una amplia gama de aguas abajo experiments que tratan de caracterizar la composición del apoplasto y cómo varía en respuesta a las especies de plantas y genotipo, desarrollo de la planta y las condiciones ambientales, o para determinar cómo los microorganismos crecen en apoplasto fluidos y responden a los cambios en su composición.

Introduction

El apoplasto de la planta es el espacio intercelular que rodea a las células vegetales. Este es un entorno dinámico en el que muchos de los procesos metabólicos y de transporte tienen lugar. El principal componente estructural de la apoplasto es la pared celular, que se monta y modificado por enzimas, proteínas estructurales y metabolitos situados dentro de la apoplasto. En las células vegetales saludables apoplasto se mantiene generalmente en un estado de acidez permite aminoácidos, azúcares y otros nutrientes para ser importados desde el apoplasto al citoplasma por H + symport 1. Durante el transporte de sacarosa, se mueve de sacarosa a partir de fuentes fotosintéticos a través del apoplasto y en la vasculatura del floema; a continuación, la sacarosa es transportada por un potencial osmótico mantenido por invertasas apoplásticas de escisión de sacarosa en los órganos del fregadero 2. Los azúcares y otros nutrientes también pueden ser transportados hacia arriba y se acumulan en las cavidades de los estomas a través de la corriente de transpiración 3.

"> El apoplasto también representa un nicho ambiental donde muchos patógenos establecen su estilo de vida parasitaria. Patógenos bacterianos de plantas tienen la capacidad de multiplicarse a altas densidades en el apoplasto, que acceden a través de las aberturas naturales tales como estomas o a través de heridas 4. La concentración de amino ácidos y otros compuestos de nitrógeno en tomate apoplasto han demostrado ser suficiente para soportar los requisitos nutricionales de los patógenos bacterianos y fúngicos 5,6. respuestas de defensa primarios hacia patógenos microbianos también se producen en el apoplasto, a saber, la producción de especies reactivas del oxígeno por peroxidasas extracelulares . y oxidasas y el fortalecimiento de la pared celular a través de la reticulación y callosa deposición 7 La pared celular vegetal es rica en metabolitos secundarios con actividad anti-microbianas, la naturaleza bioquímica de estos metabolitos secundarios varía entre las especies 8.

Como resultado de la mención anteriormenteed y otros procesos, el líquido apoplástico hoja contiene una variedad de proteínas, azúcares, ácidos orgánicos, aminoácidos, metabolitos secundarios, metales y otros cationes (por ejemplo, Mg 2+, K +, Na +, Ca 2+, Fe 2/3 +). Concentraciones de soluto en el apoplasto de brotes se controlan en gran medida por el equilibrio de los procesos de transporte que ocurren entre el apoplasto y el xilema, floema y el citoplasma 9. Sin embargo, las reacciones metabólicas y el crecimiento microbiano también consumen o producen solutos apoplásticas. La composición del apoplasto se sabe que difieren entre las especies de plantas y genotipos y en respuesta a las cambiantes condiciones ambientales, incluyendo la luz, la nutrición y bióticos y abióticos 9. Mediante el estudio de la composición de la apoplasto y cómo cambia, incluyendo propiedades tales como redox y el potencial osmótico, pH, nutrientes / disponibilidad metabolito y las actividades enzimáticas, se puede obtener nuevos conocimientos sobre cómo las plantas reresponden a su entorno. Comprensión o caracterizar los cambios moleculares que se producen en la solución apoplasto se complica debido a que es un compartimiento espacialmente estructurado y dinámico en el que los metabolitos y / o iones pueden ser volátiles, transitoria o asociado con la pared celular y la membrana plasmática. Además, se requieren diferentes técnicas analíticas para cubrir la gama de diferentes tipos químicos.

Para estudiar la composición de la apoplasto soluble, líquido usualmente necesita ser extraído del tejido. Existen varios métodos para extraer fluido apoplasto de diversos tejidos, incluyendo un método de la tira de filtro nueva propuesta de 10, pero el método de extracción más establecido para las hojas es la infiltración-centrifugación. Esta técnica ha sido evaluada previamente 11-13 y Lohaus et al. 2001 14 proporcionar un examen a fondo de muchos de los parámetros técnicos del método. Como implica el nombre, la infiltración-centrifugación técnica es un método de dos etapas que implica esencialmente la sustitución del espacio de aire apoplástico con un fluido de infiltración acuosa, que se mezcla con el líquido apoplástico nativo, seguido de la recuperación de la mezcla de fluido de infiltración / apoplástico por centrifugación suave de las hojas. Como se diluye el líquido recuperado y no contiene todos los compuestos presentes en el apoplasto (véase más adelante), este líquido se conoce comúnmente como apoplasto fluido de lavado (AWF), o fluido de lavado intercelular veces, en lugar de líquido apoplástico. La técnica de infiltración-centrifugación es fácilmente escalable que permite muestras individuales o agrupados AWF de volumen adecuado que se generen y se sometieron a una amplia gama de técnicas analíticas bioquímicas y aguas abajo (por ejemplo, la electroforesis de proteínas, la medición de la actividad enzimática, RMN, muchos tipos de cromatografía y la masa espectrometría). Hoja AWF también es útil como un apoplasto imitando medio de crecimiento para el estudio de la interacción de colonizar la planta microbios ingenioh su entorno 5.

En los siguientes protocolos se describe cómo realizar la técnica de infiltración-centrifugación utilizando Phaseolus vulgaris cv. Tendergreen hojas, y proporcionar algunos ejemplos de análisis posteriores con un enfoque en la metabolómica. Es importante destacar que los métodos para evaluar la calidad de AWF se proporcionan junto con consejos para optimizar el procedimiento para diferentes tipos de hojas.

Protocol

NOTA: La elección del material de partida de la hoja y la normalización de las condiciones de crecimiento de las plantas es fundamental, ya que estos factores pueden afectar en gran medida la calidad, la variabilidad y el rendimiento de AWF (Figura 1). Parámetros a tener en cuenta se muestran en la Tabla 1 y se analizan con más detalle en la discusión. Parámetro Ejemplo estandarizaciones Phaseolus vulgaris Solanum lycopersicum Arabidopsis thaliana Tipo de hoja Las primeras hojas verdaderas, completamente expandida, saludable 2 ª y 3 ª hojas a partir de la parte inferior, 4 folletos más grandes toman folleto apical no se utiliza para la extracción apoplasto Hojas en roseta totalmente expandidas Edad de la planta 21 días 7-9 weeks </td> 7 semanas Hora del día Mitad del período de luz (12:00) Mitad del período de luz (12:00) Mitad del período de luz (12:00) Hidratación Todas las plantas bien regadas 1 hora antes de la cosecha Todas las plantas bien regadas 1 hora antes de la cosecha Todas las plantas bien regadas 1 hora antes de la cosecha Luz 16 h de luz, 400 mol m -2 s -1 16 h de luz, 400 mol m -2 s -1 10 horas de luz (día corto) desde la semana 2, 400 mol m -2 s -1 Humedad 70% 70% 70% Temperatura 22 ° C la luz, 18 ° C oscura 22 ° C la luz, 18 ° C oscura 21 ° C Tabla 1. Ejemplos de pará estandarizadatros de hojas utilizadas en extracciones AWF. 1. Generación de apoplasto Lavado Fluid NOTA: Durante este protocolo materila peligrosos inculding patógenos microbianos a partir de hojas infectadas no se debe lavar por el desagüe; se deben utilizar procedimientos más adecuados de eliminación. Elige un aparato basado en el tamaño de la hoja: Infiltrarse en hojas más pequeñas (por ejemplo, Arabidopsis, frijol) utilizando una jeringa sin aguja. Utilice un frasco de vacío para infiltrarse en las hojas que son demasiado grandes para caber en una jeringa. Utilice el método de frasco vacío para infiltrarse en varias hojas a la vez. Divida hojas que son demasiado grandes para el método de infiltración disponibles en pequeñas secciones usando una cuchilla de afeitar. Secciones de hojas Enjuague completamente cortadas en agua destilada antes de la infiltración para eliminar los contaminantes citoplásmicos que exudan de las células dañadas. La infiltración de la hoja usando una jeringa de 60 ml: Separe la hoja de laplanta en el peciolo usando una cuchilla de afeitar. Para hojas compuestas, tales como tomate, separar folletos en la peciólulo. Enjuague la hoja recién extirpado por inmersión en agua destilada para eliminar contaminantes de la superficie de la hoja. Seque la hoja secando suavemente con papel absorbente o papel. Medir el peso de la hoja antes de la infiltración. Rodar con cuidado y / o doblar la hoja en una jeringa de 60 ml y llenar la jeringa con agua destilada (otros fluidos de infiltración pueden ser utilizados, véase el debate). Expulsar todo el aire dentro de la jeringa al tiempo que reduce el émbolo hasta aproximadamente la marca de 40 ml. Cubrir la punta de la jeringa, ya sea con un dedo con guante o un trozo de Parafilm, a continuación, crear una presión negativa dentro de la jeringa tirando del émbolo hacia el exterior hasta la marca de 60 ml. Suelte lentamente el émbolo. NOTA: la liberación de la presión puede resultar en la lisis celular y la contaminación citoplasmática rápidamente. Desenchufe la punta de la jeringa y se expulsa el aire, y luego vuelva a conectar la punta y pulsemás hacia abajo sobre el émbolo para crear una modesta cantidad de presión positiva. Repita los pasos 1.2.5 – 1.2.6 hasta que la hoja está completamente infiltrada, como se ve por el color oscuro de las zonas infiltradas. Retire la hoja de la jeringa. Suavemente pero a fondo secar la hoja con papel absorbente para eliminar el líquido de la superficie. Medir el peso de la hoja infiltrada. Calcular la diferencia de peso antes y después de la infiltración que se aproxima estrechamente el volumen de infiltración. Hoja infiltración de frasco de vacío: Separe la hoja de la planta en el pecíolo utilizando una hoja de afeitar. Enjuague la hoja recién extirpado por inmersión en agua destilada para eliminar contaminantes de la superficie de la hoja. Seque la hoja secando suavemente con papel absorbente. Medir el peso de la hoja antes de la infiltración. Coloque la hoja (u hojas si infiltrarse múltiples hojas) en un 250 ml o más grande lado frasco brazo containing agua destilada (otros fluidos de infiltración se pueden usar, véase la discusión). Cubrir la totalidad de las hojas con el líquido. Aplicar un vacío en el matraz. Agitar suavemente para liberar las burbujas de aire de las hojas. Con cuidado y lentamente liberar el vacío. NOTA: liberar el vacío rápidamente puede resultar en la lisis celular y la contaminación citoplasmática. Repita el paso 1.3.5 hasta que la hoja está completamente infiltrada, como se ve por el color oscuro de las zonas infiltradas. Retire la hoja del matraz. Suavemente pero a fondo secar la hoja con papel absorbente para eliminar el líquido de la superficie. Medir el peso de la hoja infiltrada. Calcular la diferencia de peso antes y después de la infiltración que se aproxima estrechamente el volumen de infiltración. Recuperación de AWF por centrifugación: Coloque la hoja en un pedazo de 4 pulgadas (10 cm) de ancho Parafilm. Con una punta de pipeta de 5 ml (o un objeto de tamaño similar),enrollar la hoja dentro del Parafilm. Inserte la hoja enrollada con punta de la pipeta en una jeringa de 20 ml. Coloque los bordes de las hojas de corte hacia arriba. Inserte la jeringa en un tubo de polietileno o policarbonato 50 ml limpio. Centrifugar la jeringa dentro del tubo durante 10 min a 1.000 xg en un rotor de cubeta oscilante a 4 ° C. NOTA: El examen visual de las hojas después de la centrifugación debe revelar que la mayoría de la infiltración de fluido ha sido expulsado. Manchas verdes más oscuros indican que se requiere tiempo de centrifugación adicional. Pipetear la AWF recuperado en fresco tubos de 1,5 ml. NOTA: El volumen de AWF debe coincidir aproximadamente con el volumen de infiltración para que la hoja; si el volumen es menos tiempo de centrifugación adicional o se requiere velocidad de centrifugación. Centrifugar las muestras AWF a 15.000 xg durante 5 min para eliminar cualquier célula o materia particulada. Alternativamente, pasar la AWF a través de un filtro de 0,22 micras a remocinco células y partículas. Pipetear el sobrenadante a un tubo nuevo. Mantener las muestras en hielo hasta el almacenamiento. Almacenar las muestras AWF a -80 ° C. 2. Los ensayos para la contaminación citoplasmática Mantener las muestras AWF en hielo para minimizar las reacciones enzimáticas (por ejemplo, proteólisis) y llevar a cabo los ensayos inmediatamente después de las etapas de centrifugación se han completado. NOTA: Para los ensayos de metabolitos, las muestras se pueden congelar inmediatamente después de la extracción y se almacenan a -80 ° C hasta su uso. Para una malato deshidrogenasa estándar (MDH) protocolo de ensayo ver 15; de otro modo utilizar un kit de ensayo comercialmente disponible MDH. Para una deshidrogenasa de glucosa-6-fosfato estándar (G6PDH) protocolo de ensayo ver 16; de lo contrario utilizar un kit de ensayo de G6PDH disponible comercialmente. Para la cuantificación de metabolitos citoplasmáticos tales como glucosa-6-fosfato (G-6-P) utilizar GC-MS como se describe en el paso 5 </strong>. De lo contrario, utilice un kit disponible comercialmente para el ensayo directo de G-6-P. 3. Cálculo del factor de dilución apoplasto Preparar dos volúmenes de fluido de infiltración utilizado anteriormente en la etapa 1.2.4 o 1.3.4 (por ejemplo, agua destilada). Añadir polvo de carmín de índigo a una solución a una concentración final de 50 mM, añadir nada a la otra. Medir la absorbancia a 610 nm (OD 610) de 200 l de la solución de infiltración índigo carmín con un lector de placas. Corrija este valor restando el OD 610 de 200 l de solución de infiltración sin índigo carmín. Sustituir este valor corregido como OD 610infiltrate en la ecuación a continuación. Realizar al menos tres infiltraciones de hoja de replicar como anteriormente (paso 1.2 o 1.3) con ambas soluciones de infiltración (con y sin índigo carmín). Después de la infiltración, rinse las hojas en agua destilada para eliminar cualquier resto de carmín de índigo presente en las superficies exteriores. Proceda con centrifugación como anteriormente (paso 1.4). Determinar la densidad óptica promedio 610 de 200 l de las extracciones de AWF índigo carmín. Corrija este valor restando el valor medio de DO 610 de 200 l de índigo carmín libre AWF. Sustituir este valor corregido como OD 610AWF en la ecuación a continuación. Calcular el factor de dilución (es decir, doble dilución) a partir de los valores de absorbancia corregida como: Apoplasto factor de dilución = OD 610infiltrate / (610infiltrate OD – OD 610AWF) Concentración o actividad Multiplique los valores de AWF por el factor de dilución para estimar la concentración / actividad en el líquido apoplástico in planta. 4. Concentración de AWF de Resistencia Total por liofilización Encienda el liofilizador y unllow que se estabilice a la temperatura y presión de trabajo. Aunar la cantidad deseada de muestras AWF frescos o almacenados. Distribuir las muestras de manera uniforme entre 2 tubos ml de centrífuga. Determinar el volumen de la reconstitución: El volumen de reconstitución = volumen antes de factor de dilución de liofilización / apoplasto Con los párpados cerrados, congelar los tubos en nitrógeno líquido. Transfiera los tubos congelados a uno o más vasos de liofilización refrigerados. Si bien la transferencia de los tubos, reemplace la tapa con una que ha sido perforado con un objeto afilado para permitir el intercambio de gases. Coloque los vasos al liofilizador y liofilizar las muestras completamente. Retire las muestras de la máquina y reconstituir el AWF añadiendo la cantidad calculada de agua destilada. Vuelva a colocar la tapa no perforada y almacenar las muestras a -80 ° C. 5. Análisis de metabolitos por cromatografía de gases espectrometría de masas 17 <ol> Pipeta 200 l de AWF en un tubo de 1,5 ml Añadir 700 l de metanol que contiene 10 mg / ml ribitol como patrón interno. Se calienta a 70 ° C durante 10 min. Centrifugar durante 10 min a 11.000 x g. Transferir 700 l de sobrenadante a un tubo de 1,5 ml frescos. Añadir 375 l de cloroformo frío y agitar durante 10 seg. Añadir 500 l de dH 2 O y agitar durante 10 segundos. Centrifugar durante 15 min a 2200 x g. Transferir 150 l de la capa acuosa superior a un nuevo tubo de 1,5 ml, a continuación, secar las muestras completamente en un concentrador de vacío sin calor. Disolver las muestras en 30 l de piridina que contienen 20 mg / ml de clorhidrato de metoxiamina. Incubar a 70 ° C mientras se agita vigorosamente durante 2 hr. Añadir 50 l de MSTFA (N-metil-N- (trimetilsilil) trifluoroacetamida). Incubar a 37 ° C mientras se agitaba durante 30 min. Transferir las muestras de GC-MS borradorviales de vidrio atible. Realizar análisis de GC-MS de las muestras. Consulte Lisec et al. 2009 17, para obtener detalles sobre la configuración del equipo GC-MS y el rendimiento.

Representative Results

Los resultados típicos para extracciones realizadas en AWF saludable de 3 semanas P. vulgaris cv. Tendergreen hojas, utilizando agua destilada como fluido de infiltración se muestran en la Tabla 2. Joven P. hojas vulgaris son susceptibles a la infiltración, y a la velocidad de centrifugación utilizado aquí (1.000 xg) la eliminación de la mayoría de fluido de infiltración por centrifugación se pueden ver directamente como las hojas vuelven a su color original verde. P. hoja vulgaris peso fresco fue en promedio de 1.1 xg antes de la infiltración y cedió 0,5 ml de AWF por gramo de peso fresco. La concentración de proteína de la AWF se determinó que era 0,18 ± 0,08 mg / ml utilizando un ensayo de proteínas Bradford estándar. El factor de dilución de estas hojas, calculados mediante la medición de la dilución índigo carmín, fue de 2,3 ± 0,3 veces. Los valores anteriores pueden variar sustancialmente entre las especies y los proyectos piloto son necesarios para determinar el rendimiento de AWF por gramo de hoja que frescoight, así como la concentración de proteína AWF y el factor de dilución que se puede esperar para un tipo de hoja determinado. El daño a la integridad de las células puede ocurrir tanto durante la etapa de infiltración, si los cambios en la presión son demasiado rápida, y durante la etapa de centrifugación, si la fuerza centrífuga es demasiado alta. Por lo tanto, es necesario para someter a ensayo muestras AWF para los marcadores de contaminación citoplasmática; idealmente, se realizan varios ensayos independientes. Aquí, los resultados de tres ensayos posibles se presentan en la Tabla 2. En extracciones bien realizados de P. vulgaris AWF, G6PDH era indetectable por un ensayo enzimático estándar. Esto es consistente con otros informes donde la actividad G6PDH se vuelve detectable sólo por encima de una fuerza centrífuga umbral de 12. En contraste, un nivel basal de actividad de la malato deshidrogenasa (2,5 U / ml) fue detectable en todos P. muestras vulgaris AWF utilizando un ensayo metabólico estándar. El aumento de la centrífuga parace encima de un umbral de 1.000 xg resultó en aumento de las actividades de MDH (resultados no mostrados). Como se sabe que el apoplasto de otras especies para contener la actividad endógena MDH 18, la cantidad detectada aquí se considera verdadera actividad apoplástico y aumentos significativos por encima de este nivel de referencia son indicativos de contaminación. Los metabolitos que se cree que son predominantemente citoplasmática, tales como hexosa-6-fosfatos, también se pueden utilizar para evaluar la contaminación de AWF. Aquí, el análisis GC-MS detecta cero o traza niveles de G-6-P en extracciones AWF. Por el contrario, en las secciones de raíz de maíz corte, G-6-P se detectó después de la extracción AWF a todas las velocidades de centrifugación y el aumento en la concentración a velocidades más altas, lo que indica la contaminación citoplasmática 10. El análisis de metabolitos por GC-MS de P. vulgaris hoja AWF produce típicamente 40-60 metabolitos identificables y un número aproximadamente igual de compuestos no identificados (Figura 2). Oácidos inorgá-, azúcares simples y aminoácidos representan la mayor parte de los metabolitos identificables, sin embargo, los metabolitos secundarios de las plantas también se han detectado y cuantificado de AWF 11. Varios picos ejemplo de estas diferentes clases de moléculas están etiquetados en la figura 2 Otras técnicas analíticas aguas abajo son aplicables a estas muestras AWF para cuantificar diversas moléculas, por ejemplo:. ICP-MS, RMN, HPLC, espectroscopía de absorción atómica, espectrometría de masas de proteínas. El componente proteico de la apoplasto también está representado en el AWF como se muestra en la Brilliant gel azul manchado SDS-PAGE Coomassie en la Figura 3. Entre otras funciones, las enzimas apoplásticas son responsables de la síntesis de la pared celular y la creación de reactivo extracelular especies de oxígeno. Los estudios proteómicos de AWF de varias especies se han identificado docenas de proteínas individuales y demostrado que el componente de proteína del apoplasto responde a Enviroestrés nmental 13,19. Lo ideal sería que el extracto de AWF debe estar libre de contaminación por proteínas citoplasmáticas como Rubisco; Sin embargo en la práctica esto es difícil de lograr. La presencia de una banda de proteína Rubisco a ~ 53 kDa tras SDS-PAGE proporciona un ensayo cualitativo más para la integridad de las muestras AWF. Por ejemplo, la muestra cargada en el carril 2 en la figura 3 contiene una mayor cantidad de contaminación que Rubisco de carril 1. Phaseolus vulgaris AWF Volumen de AWF (ml g -1 hoja FW) 0.49 ± 0.09 Conc proteína. (Mg ml -1) 0.18 ± 0.08 Factor de dilución 2,3 ± 0,3 Actividad G6PDH (U ml -1) <td> No detectado Glc-6-P (mg ml -1) ninguno detectado Actividad MDH (U ml -1) 2,5 ± 0,9 Tabla 2. Los resultados típicos para extracciones AWF de P. vulgaris cv. Tendergreen hojas. Figura 1. Las tareas de extracción apoplasto estándar. Los números se refieren a los pasos en el protocolo. Figura 2. Un ejemplo GC-MS cromatograma de P. Vulgaris cv. . Tendergreen AWF Los picos de metabolitos ejemplo numeradas son: 1-malonato, 2-fosfato, 3-succinato, 4-desconocido, 5-malato, 6-asparagina, 7-ribitol (st internaandard), 8-citrato, 9-glucosa, 10-inositol, ácido 11-cafeico, 12-sacarosa. Figura 3. Un ejemplo SDS-PAGE gel teñido con Coomassie de P. Vulgaris extractos de hoja de AWF. Este gel proporciona una comparación entre los componentes proteicos de dos extracciones AWF que difieren en la cantidad de contaminación citoplasmática por la abundante enzima Rubisco plastidial. Después de la extracción AWF ambas muestras se sometieron a la precipitación de proteínas acetona en un exceso de 4 veces (v / v) de acetona fría y resolubilized en agua a un décimo del volumen original. Los carriles 1 y 2 contienen 40 g de proteína. La banda correspondiente a la cadena de gran Rubisco (~ 53 kDa) se indica mediante una flecha. M r: proteína de marcadores de peso molecular.

Discussion

Optimización de la fuente de tejido de la planta

La variación biológica y técnica puede ser grande cuando se realiza apoplasto extracciones, por lo tanto un flujo de trabajo altamente estandarizado es útil para aumentar la continuidad a través de experimentos (Figura 1). Es importante destacar que la fuente de tejido de la planta debe ser estandarizada, incluyendo el tipo de hoja, edad de la hoja, de crecimiento / condiciones ambientales y hora del día (Tabla 1). Existen grandes diferencias en la facilidad con que las diferentes hojas están infiltrados y, posteriormente, la AWF recuperaron por centrifugación; estas diferencias se correlacionan con el número de estomas, tamaño de la abertura y la resistencia mesófilo 12,14. Incluso entre los diferentes cultivares de P. vulgaris hay grandes diferencias en la facilidad y el rendimiento del procedimiento de extracción AWF; por ejemplo, las hojas de la variedad Tendergreen utilizado aquí son más susceptibles a la extracción AWF utilizando este método que el cultivar Canadian Wonder. DentroP. vulgaris las primeras hojas verdaderas son los más grandes y los más fáciles de infiltrar, lo que la elección obvia para extracciones apoplásticas. El volumen de aire y agua apoplástico se ha demostrado que varían con la edad de la hoja en varias especies que conducen a diferencias en AWF de extracción 12,14. En P. vulgaris, las hojas más viejas se vuelven mucho más difícil de infiltrar y rendir menos AWF la centrifugación; Por lo tanto, las hojas se cosecharon cuando alcanzaron plena expansión. Las hojas que son difíciles de infiltrar exigir posteriormente velocidades de centrifugación más altos para recuperar la AWF. Por ello se debería examinar cuidadosamente varios tipos de hojas diferentes y variedades antes de decidir sobre una fuente de tejido para las extracciones AWF gran escala.

Las condiciones de crecimiento de la planta también deben normalizarse tanto como sea posible en el contexto del experimento. El uso de cámaras de cultivo es preferible, ya que permiten la humedad constante, la temperatura y lighregimientos t intensidad que se mantenga. La recolección de hojas siempre debe ocurrir en el mismo momento del día porque las concentraciones de metabolitos, enzimas, etc. varían durante el ciclo diurno 14. Por último, para asegurar que la planta deja todos tienen la presión de turgencia similares, las plantas deben regarse poco antes (~ 1 h) de la cosecha.

Optimización de la infiltración de la hoja y centrifugación

Contaminación citoplasmática indeseable de la AWF debido a la lisis celular parcial resultará si el estrés mecánico encontrado por las células es demasiado alta durante los pasos de infiltración o centrifugación. Por lo tanto, el procedimiento para un tipo dado de la hoja debe ser un equilibrio optimizado entre maximizar el rendimiento y minimizar la contaminación citoplasmática de la AWF. En todos los casos, se debe utilizar la velocidad de centrifugado baja a la que AWF se puede recuperar para evitar una posible rotura mecánica de las células de las hojas. Optimización de la centrifuvelocidad gación debe determinarse empíricamente para cada tipo de hoja por el seguimiento del volumen recuperado y apoplasto la contaminación a través de una gama de velocidades de centrifugación. Se ha observado que las actividades de enzima marcadora, como MDH, G6PDH y la isomerasa de glucosa-fosfato, siguen siendo bajos hasta que una fuerza centrífuga de umbral es superado, por encima del cual estas actividades aumentan rápidamente, presumiblemente debido a las fugas citoplasmática 9,12,14. El uso de Parafilm para el apoyo durante la etapa de centrifugación, como se ha señalado por Baker et al. 2012 11, puede mejorar la eficacia de la extracción AWF y puede minimizar el daño mecánico a la lámina de la hoja causado por plegado excesivo y compresión. Además, el uso de Parafilm mejora la visualización de la hoja después de la centrifugación cuando uno debe examinar la hoja de los daños y la integridad de la extracción AWF.

Nouchi 12 describen la optimización de la recuperación AWF de secciones de hojas de arroz corte, que son difficult infiltrarse y requieren velocidades de centrifugado superiores a recoger AWF debido a sus pequeñas aberturas de los estomas. Mejora de la humectación de la superficie de la hoja de arroz, ya sea por remojo previo de las hojas en agua destilada o la adición de un agente tensioactivo para el fluido de infiltración, facilitado el proceso de infiltración. Una velocidad de centrifugado más alta (6.000 xg) también se utilizó durante el seguimiento de la contaminación apoplástico 12. Cuando se utilizan secciones de hoja de corte siempre hay el riesgo de que la contaminación citoplasmática será más prevalente incluso con un lavado extensivo de los sitios de la herida; hojas cortadas únicamente deben utilizarse cuando sea necesario.

Para muchos estudios de agua destilada se utiliza como fluido de infiltración 11. Sin embargo, los compuestos se pueden añadir al fluido de infiltración, tales como sales o tampones, para mejorar la extracción de ciertos compuestos apoplásticas, especialmente proteínas 13. Lohaus 14 evaluó el efecto de la fuerza iónica y osmótica on la composición de la AWF recuperado y los encontró a ser insignificante. Los cambios en el pH del medio de infiltración, sin embargo, pueden afectar a la composición AWF 14.

El manejo adecuado y el almacenamiento del fluido apoplástico extraído es importante. AWF se ha demostrado que contienen una abundancia de proteasas y otras enzimas 13,20, así como compuestos orgánicos volátiles. Por lo tanto, para reducir los cambios en la composición de AWF después de la recuperación, se recomienda mantener las muestras en hielo o almacenados a -80 ° C. Además, los ensayos enzimáticos de AWF se debe realizar lo más pronto posible después de la extracción para limitar la inactivación de la enzima debido a la proteolisis, dilución prolongado o congelación-descongelación.

El proceso de infiltración diluye el líquido apoplástico y a menudo es necesario para determinar el alcance de esta dilución. La etapa de centrifugación también puede diluir la AWF con agua de los compartimientos intracelulares. Se necesita un factor de dilucióned para estimar in vivo apoplasto concentraciones químicas en cuando las mediciones se hacen en AWF. También se necesita un factor de dilución para concentrar AWF de nuevo a plena potencia cuando está siendo usado como un apoplasto imitando medio de crecimiento para los microbios – juego tanto en las concentraciones de metabolitos in vivo con la mayor precisión posible. Existen varias variaciones en el método descrito en el paso 4 para determinar el factor de dilución AWF mediante la medición de la dilución de un compuesto marcador añadido al fluido de infiltración. Para todos los métodos de dilución AWF el cálculo asume que el fluido de infiltración no está apreciablemente absorbe o se diluirá con las células de las hojas durante el proceso de recuperación AWF. Esta hipótesis ha sido verificada previamente para el paso de infiltración 14 pero no está verificado por la etapa de centrifugación. El compuesto marcador tampoco debe ser absorbida, transportada o mientras modificado en el apoplasto. Indigo carmín es el más utilizado y probado a fondo de los colorantes utilizadospara los cálculos de dilución AWF. Indigo carmín muestra una absorbancia baja a la resina de intercambio catiónico y las paredes celulares aisladas y ha demostrado ser adecuado para los cálculos AWF en Brassica napus, Pisum sativum, Solanum lycopersicum y Glycine max 11,21,22. Sin embargo, en algunos tipos de hojas, por ejemplo, el arroz y el pepino, índigo carmín parecía no ser recuperado totalmente después de la infiltración, lo que llevaría a una subestimación del factor de dilución AWF 12,21. La falta de recuperación de índigo carmín puede ser debido a su susceptibilidad a la escisión en sulfonato de isatina por superóxido 23, que se sabe que se produce en el apoplasto, especialmente bajo estrés 24. La escisión de índigo carmín en sulfonato de isatina se traducirá en una pérdida de absorbancia a 610 nm y un incremento a 245 nm. Si esta reacción se produce en una medida apreciable en el apoplasto, o si esta reacción puede ser inhibida por la adición de eliminadores de superóxido para infiltratlíquido iónico no se ha investigado hasta la fecha. Azul de dextrano se ha usado en lugar de índigo carmín para la cuantificación del factor de dilución AWF en el arroz hojas 12, aunque no se ha informado de su estabilidad y recuperación de la AWF. Alternativamente, los compuestos radiomarcados tales como [14 C] de sorbitol u otros estándares internos cuantificables se pueden utilizar en lugar de colorantes y la disminución de la radiactividad o la concentración mide y se utiliza para calcular el factor de dilución de una manera análoga 11,14,25.

Limitaciones de la técnica

Existen algunas advertencias para el método de aislamiento AWF infiltración-centrifugación. En primer lugar, la dilución de la apoplasto durante la infiltración puede obtener una respuesta de la planta. Si las células de las hojas que rodean detectan una concentración disminuida para ciertos componentes del fluido apoplástica, pueden responder mediante la excreción de metabolitos adicionales, distorsionando la interpretación de las concentraciones de metabolitos. Ense observó una evaluación de este problema que ni el tiempo entre la infiltración y la centrifugación ni diferencias moderadas en la fuerza iónica del fluido de infiltración afectó a la composición de la AWF extraída 14,22. Por lo tanto, los artefactos resultantes de apoplasto se cree dilución para ser mínimo.

Una segunda desventaja potencial es que la elución de AWF por centrifugación no captura todas las moléculas presentes en el apoplasto por varias razones. Algunos compuestos, en cationes y proteínas particulares pueden estar estrechamente asociados con la pared celular cargada negativamente, y no se eluyen con la AWF 13. Otras moléculas tales como proteínas pueden ser demasiado grandes para eluir eficientemente fuera de la apoplasto a las velocidades de centrifugación utilizados 14. Especies de oxígeno reactivas son una clase importante de compuesto producido en el apoplasto, pero debido a la naturaleza de corta duración de estos compuestos, y los requisitos especificados para su producción, su presencia no está bien capturado por extracción AWF. No se sabe con qué precisión AWF representa la composición in vivo del fluido apoplasto y esto puede variar entre las especies.

Existen varios ensayos para determinar la contaminación citoplasmática, aunque ninguno es universalmente aceptada. Los ensayos de enzimas citoplasmáticas predominantemente (por ejemplo, G6PDH, fosfato isomerasa de hexosa, MDH) tienen la ventaja de ser fácil de realizar, pero puede no correlacionarse bien con fugas citoplasmática 14,18. La evaluación de los metabolitos citoplasmáticos (por ejemplo, fosfatos de hexosa, clorofila) es quizás más indicativo pero no está bien establecida 11. Sin embargo, cualquier tipo de ensayo puede ser útil para la cuantificación relativa de contaminación entre muestras apoplástico. Idealmente, múltiples mediciones independientes deben ser utilizados para validar la integridad de la muestra AWF.

Si bien reconocen sus limitaciones, la infiltración-centrifugatien técnica descrita aquí sigue siendo una técnica sencilla y robusta en el estudio de las proteínas apoplásticas, metabolitos primarios y secundarios e iones inorgánicos.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants BB/J016012/1 and BB/E007872/1 from the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) to Gail Preston.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Eppendorf Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22364111
razor blade Fisher 12-640 
60 ml syringe Becton Dickinson 300865
20 ml syringe Becton Dickinson 300613
4 inch parafilm Bemis PM-996
side arm flask SciLabware 12972831
vacuum source
5 ml pipette tips Fisher 50-813-28 
centrifuge Beckman Coulter 392932
Swinging bucket rotor Beckman Coulter 369702
indigo carmine Sigma I8130
microplate reader Tecan Infinite 200
96 well plates Becton Dickinson 353072
freeze dryer SciQuip Christ Alpha 2-4 LD
microcentrifuge biorad 166-0612EDU
oxaloacetic acid Sigma O4126
D-glucose-6-phosphate Sigma G7250
NADH Roche 10128023001
MDH assay kit Biovision K654-100
G6PDH assay kit Sigma MAK015-1KT
G-6-P assay kit Biovision K657-100
ribitol Sigma A5502
methanol Sigma 650471
chloroform Sigma 472476
vacuum concentrator Thermor Scientific SC250EXP
methoxyamine hydrochloride Sigma 226904
N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide Sigma 394866
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References

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O’Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example. J. Vis. Exp. (94), e52113, doi:10.3791/52113 (2014).
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