Large-Scale Purificazione di suino o bovino fotorecettore Outer Segmenti per fagocitosi saggi su cellule retiniche dell'epitelio pigmentato

Nella retina, la visione viene attivato per isomerizzazione di molecole fotosensibili denominate opsine, prima di essere trasformato in un segnale che può essere trasmesso tra i neuroni fino alle aree visive del cervello. Queste molecole sono incorporati in pile di dischi membranose simili a frittelle che costituiscono le porzioni segmento esterno dei fotorecettori (PRS). Essere sottoposti a costante esposizione alla luce e quindi notevoli livelli di stress ossidativo, PR continuamente rinnovare i loro segmenti esterni per limitare il potenziale danno ossidativo. Segmenti esterni dei fotorecettori sono in stretto contatto con microvilli apicale delle retina epiteliali del pigmento (RPE) cellule vicine. Cellule RPE costituiscono la parte esterna della barriera emato-retinica e garantire numerosi compiti che sono cruciali per la salute e la funzione fotorecettori ^1, come tempra raggi luminosi con pigmenti di melanina, ri-isomerizzazione del componente opsin fotoreattivo retina, fornendo nutrienti e gCRESCITA fattori, partecipando a disposizione PR metabolita.

Inoltre, le cellule RPE eliminano spesi POS e riciclano i loro componenti, un'occupazione quotidiana che è regolato dal ritmo circadiano in retina di mammifero ^2,3. La clearance di capannone POS è assolutamente necessario per la sopravvivenza PR. Quando è completamente abrogato, POS detriti si accumulano e PRS degenerano causando una rapida ^4,5 perdita della vista. Se il profilo ritmica viene persa e sostituita da un'attività costante, PR e RPE difetti accumulano con l'età ^6. Pertanto, è molto importante per caratterizzare la regolazione molecolare di RPE fagocitosi in vitro per comprendere fenotipi legati al suo erettile. È interessante notare che il macchinario molecolare in cellule RPE è molto simile a quello utilizzato dai macrofagi per eliminare cellule apoptotiche ed entrambi sono determinati dal riconoscimento della fosfatidilserina esposta su detriti fagocitica ^7-9. Tuttavia, le cellule RPE e macrofagi regolano phagocytosis diversamente, come macrofagi optare per l'eliminazione immediata di cellule apoptotiche al momento dell'incontro, mentre le cellule RPE ritmicamente inghiottire POS solo una volta al giorno, nonostante il loro contatto permanente con i segmenti esterni. Questo suggerisce specifici meccanismi di regolazione che non sono ancora pienamente compresi.

Molte delle molecole implicati nel meccanismo RPE fagocitica sono stati identificati o convalidato grazie all'utilizzo di POS isolata e coltura cellulare saggi fagocitosi. Il recettore alphavbeta5 integrina situata sulla superficie cellulare apicale RPE, in coordinamento con il suo ligando MFG-E8, si lega selettivamente al POS ^10-12, che vengono poi interiorizzata attraverso il MerTK tirosina chinasi del recettore ^13-15. Il recettore scavenger CD36 ha dimostrato di partecipare aspirazione POS ed influenzare la velocità ^16,17, e potrebbe essere utilizzato come sensore di fosfolipidi ossidati in superficie POS ^18. Internalizzazione deve il reclutamento di F-actina citoscheletro-assproteine ​​ociated quali annessina 2 ^19, miosina II ²⁰ e miosina VIIA ^21,22. Sono utilizzati anche POS Native o ossidato in vitro per capire invecchiamento fenotipi di cellule RPE in vivo legati all'accumulo di mal digerito POS ossidato ^23-28. La generazione di cellule RPE derivate da cellule staminali ha avviato una nuova applicazione per POS isolati che vengono utilizzati per dimostrare la funzionalità delle cellule prima di essere trapiantate in animali o pazienti ^29,30,27.

Prima descritto da Molday e colleghi nel 1987 ^31, il protocollo per l'isolamento di POS bovina combina un passo ultracentrifugazione di omogenati retiniche sui continui gradienti di saccarosio con l'osservazione del caratteristico aspetto arancione di greggi fotopigmento retinica (portando 11- retinica cis). Negli ultimi 10 anni, a causa di precauzioni prese, al fine di minimizzare il rischio di morbo della mucca pazza, l'uso degli occhi suina è diventato sempre più dinamicongly prominente. Il protocollo qui descritto viene illustrato come ottenere grandi quantità di POS da suina o bovina occhi che possono essere aliquotati e conservati per lunghi periodi di tempo. Questo elimina la necessità di preparare POS da occhi roditore, che richiede l'utilizzo di un gran numero di animali per la preparazione e il dosaggio POS ^32,33,21,22. Inoltre, dettagli di etichettatura POS prima memorizzazione utilizzando molecole fluorescenti sono indicati, per quantificare e visualizzare POS in modo semplificato e comparabile per alcune applicazioni rispetto all'etichettatura POS dopo la fagocitosi dosaggio ^32,10. Pertanto, queste grandi scorte consentono riproducibilità e facilità d'uso in molti diversi tipi di esperimenti.