Summary

Isolatie en Kwantitatieve Immunocytochemische karakterisering van primaire Myogene cellen en fibroblasten van Human Skeletal Muscle

Published: January 12, 2015
doi:

Summary

The main adherent cell types derived from human muscle are myogenic cells and fibroblasts. Here, cell populations are enriched using magnetic-activated cell sorting based on the CD56 antigen. Subsequent immunolabelling with specific antibodies and use of image analysis techniques allows quantification of cytoplasmic and nuclear characteristics in individual cells.

Abstract

Het herstel en regeneratie van de skeletspier vereist de actie van satelliet-cellen, die de bewoner spierstamcellen zijn. Deze kunnen worden geïsoleerd uit menselijke spier biopten middels enzymatische digestie en hun myogene eigenschappen bestudeerd in kweek. Kwantitatief de twee hechtende celtypen verkregen enzymatische digestie zijn: (i) de satelliet cellen (genoemd myogene cellen of spier voorloper cellen), oorspronkelijk geïdentificeerd als CD56 + en later als CD56 + / desmine + cellen en (ii) spier- afgeleide fibroblasten, geïdentificeerd als CD56 en TE-7 +. Fibroblasten vermenigvuldigen zeer efficiënt in de cultuur en in gemengde celpopulaties deze cellen myogene cellen aan de cultuur domineren kan overlopen. De isolatie en zuivering van verschillende celtypen van menselijke spier is dus een belangrijke methodologische overweging wanneer het proberen om de aangeboren gedrag van beide typen cellen in kweek te onderzoeken. Hier descr weIbe een sorteersysteem gebaseerd op de zachte enzymatische digestie cellen met collagenase en dispase gevolgd door magnetische celsortering (MACS) dat een hoge zuiverheid (> 95% myogene cellen) en goede opbrengst (~ geeft beide 2,8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 cellen / g weefsel na 7 dagen in vitro) voor experimenten in de cultuur. Deze benadering is gebaseerd op het incuberen van het gemengde spier afgeleide celpopulatie met magnetische microbolletjes beads geconjugeerd met een antilichaam tegen CD56 en vervolgens passeren cellen hoewel een magnetisch veld. CD56 + cellen gebonden aan microbolletjes worden bewaard door het veld, terwijl CD56 cellen passeren ongehinderd door de kolom. Celsuspensies van elke fase van het sorteerproces kunnen worden uitgeplaat en gekweekt. Na een bepaalde ingreep, celmorfologie en de expressie en lokalisatie van eiwitten inclusief nucleaire transcriptiefactoren kan worden gekwantificeerd middels immunofluorescentie labeling met specifieke antilichamen en een afbeelding pEHANDELING en analyse pakket.

Introduction

Het herstel en regeneratie van de skeletspier vereist de actie van satelliet-cellen 1, de myogene stamcellen 2,3. In vivo deze cellen bestaan ​​in een reversibel rusttoestand gelegen tussen de sarcolemma en basale lamina van elke myofibre, maar geactiveerd worden om te woekeren, zekering en differentiëren spierweefsel beschadigd, gerepareerd en geregenereerd 3. Satelliet-cellen kunnen worden geïsoleerd uit jonge en oudere humane spierbiopsie monsters middels enzymatische digestie 4 en de myogene eigenschappen kunnen vervolgens worden onderzocht in primaire kweek 5. De efficiëntie van dit isolatieproces met betrekking tot zowel opbrengst en zuiverheid van de celpopulatie afhankelijk van de gebruikte methoden en kunnen verschillen van monster tot monster. De twee belangrijkste aanhanger celtypen verkregen van enzymatische afbraak zijn de satelliet cellen (nu genoemd myogene cellen of spier voorloper cellen), aanvankelijk geïdentificeerd als CD56 + / desmine cellen, en mu-SCLE afgeleide fibroblasten, geïdentificeerd als CD56 en TE7 + cellen 5. Fibroblasten hebben een snelle proliferatieve tarief en geen onomkeerbare groeistop en terminale differentiatie op cel-cel contact achtige myogene cellen niet ondergaan; dus in gemengde populatie, kan fibroblasten myogene cellen overspoeld met de cultuur domineren.

Fibroblasten vaak gezien als een irritatie voor spier biologen, maar er is nu een groeiende interesse in fibroblasten als cellen waard studie op zich, vooral omdat zij aangetoond dat een coöperatieve rol myogene cellen tijdens spier herstel 6 . De isolatie en zuivering van verschillende celtypen van menselijke spier is dus een belangrijke methodologische overweging wanneer het proberen om de aangeboren gedrag van beide celtypen in kweek te onderzoeken. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een methode waarbij cellen kan worden gesorteerd voor verdere studie en / of geteld engeanalyseerd. FACS is aangetoond betrouwbaar verrijken menselijke myogene cellen, maar de opbrengst aan cellen voor verdere kweek is vooralsnog niet hoog 7 geweest. Gezien de beperkte replicatie potentieel van somatische cellen, zoals satelliet-cel-afgeleide myogene cellen en de zeer slechte proliferatie en differentiatie in verband met veroudering 4, zijn meer zachte aanpak vereist. Single spiervezels culturen bieden een andere, minder agressief, betekent het verkrijgen van muizen satelliet-cellen nog in hun sublaminal niche en na hun activering in cultuur 8,9 inwoner. Dit is echter vaak niet mogelijk uit menselijke spierbiopsie materiaal (omdat vezels nauwelijks zijn te verkrijgen pees pees) waardoor deze techniek niet toegankelijk voor veel onderzoekslaboratoria geïnteresseerd om menselijke spier afgeleide cellen zijn. Bovendien is de enkele vezel techniek maar korte tijd celaantallen.

Hier een sorteersysteem gebaseerd op het gen beschrijven weTLE enzymatische digestie cellen met collagenase en dispase gevolgd door twee opeenvolgende ronden van magnetisch geactiveerde celsortering (MACS) dat zowel een hoge zuiverheid (> 95% myogene cellen) en opbrengst (~ geeft 2,8 x 10 6 ± 8.87 x 10 5 cellen / g weefsel) voor experimenten in de cultuur. CD56 wordt beschouwd als de gouden standaard oppervlak marker voor de identificatie van menselijke satelliet cellen in situ 10 en in vitro 11 en de ideale oppervlaktemerker kandidaat voor kralen bevestiging. In deze benadering CD56 antilichamen geconjugeerd aan ijzeroxide en polysaccharide bevattende superparamagnetische gebonden aan cellen en door een hooggradiënte magnetische celscheidingskolom geplaatst in een sterk magnetisch veld 12,13. De scheiding kolommen zijn gevuld met een matrix van ferromagnetische staalwol of ijzeren bolletjes die dienen om magnetische veldlijnen zich aan hun oppervlak die sterke magnetische veld gradiënten (~ 4tesla) 14. In deze kolommen zelfs licht magnetische cellen worden aangetrokken en geadsorbeerd aan het oppervlak 14. Ongebonden (CD56 -) cellen passeren de kolom terwijl CD56 + cellen gelabeld met magnetische microbolletjes worden behouden tot verwijdering uit het magnetische veld 12,15.

Celsuspensies van elke fase van het sorteerproces kan worden geplateerd op de gewenste dichtheid voor verdere experimenten. Naar aanleiding van een bepaalde interventie van de cellulaire bestanddelen kunnen worden geïdentificeerd met behulp van immunocytochemie, afgebeeld met behulp van wide-field of confocale fluorescentie microscopie en kwantitatief geanalyseerd met behulp van een beeldanalyse aanpak die een snelle objectieve meting van alle gelabelde cellen in een bepaalde afbeelding maakt. In ons laboratorium hebben we deze dubbele immunomagnetische sortering benadering gevolgd door beeldanalyse 16 gebruikt om dat CD56 te tonen de menselijke fibroblasten gemakkelijk transdifferentiëren tot adipocyten, terwijl myogenic cels satelliet oorsprong zijn zeer resistent tegen deze adipogene omzetting 5.

Protocol

LET OP: Voor de studies in ons lab alle vakken gaven hun schriftelijke, geïnformeerde toestemming om deel te nemen en alle experimenten werden uitgevoerd met goedkeuring Britse National Health Service ethische commissie (Londen Research Ethics Committee; referentie: 10 / H0718 / 10) en in overeenstemming met de Human Tissue Act en de Verklaring van Helsinki. 1. Eerste Voorbereiding Voorafgaand aan spierbiopsie (15 min) Maak menselijk skelet spiergroei medium. Om een afgestudeerd …

Representative Results

Gezuiverde myogene cellen en fibroblasten worden gekweekt in adipogene differentiatie medium gedurende drie dagen, gevolgd door adipogenic voedings- middel van ergens tussen 7-30 dagen op hun vermogen om adipogenese beoordelen. De gezuiverde celpopulaties, Oil Red O kleuring in combinatie met immunokleuring voor adipogene en myogene lineage markers bleek dat alleen de fibroblast fractie staat adipogene differentiatie (figuur 2) was. De massieve ophoping van vet door de fibroblasten is zichtbaar voor het…

Discussion

We hebben een immunomagentic sorteren procedure beschreven voor de selectieve verrijking van de menselijke spier-afgeleide voorlopers van kleine monsters van spierbiopsie materiaal. Deze techniek onschatbare waarde in ons laboratorium voor het overwinnen van het verlies van menselijk spier afgeleide culturen fibroblasten, maar ook voor het begrijpen van de unieke gedrag van verschillende populaties van spier afgeleide voorlopercellen. Eenmaal gezuiverd myogene cellen kunnen worden onderzocht op veranderingen in eiwit en…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Carl Hobbs and Lindsey Majoram for their technical assistance, and Professor Pat Doherty for use of microscopy facilities. Dr. Agley was supported by a studentship from King’s College London. Funding from the Spurrell Trust is also acknowledged.

Materials

Collagenase  D Roche  11088866001
Dispase II Sigma D4693-1G Must be filter sterilized before use
Trypsin/EDTA (Gibco) Invitrogen 15400-054
100 micron cell strainer BD Biosciences 352360
Collagen solution ( 3 mg/ml in 0.1% acetic acid) Sigma, Dorset, UK C8919 
Minisart SRP15 syringe filter (0.2 micron) Sartorius 17573ACK Polytetrafluorethylene (PTFE) membrane
CD56 human Microbeads Miltenyi Biotech 130-050-401 Be aware of the limited shelf life of microbeads
Anti- fibroblast Microbeads, human Miltenyi Biotech 130-050-601
40 μm Pre-separation filters Miltenyi Biotech 130-041-407
Large Cell Collumns Miltenyi Biotech 130-042-202 These columns come with a flow resistor. Use of the flow resistor is not necessary to obtain the high myogenic purities described here.
LS columns  Miltenyi Biotech 130-042-401
MiniMacs Seperator Miltenyi Biotech 130-042-102 This separator fits the large cell column but not the LS column. 
MidiMACS Miltenyi Biotech  130-042-302
MACS multistand Miltenyi Biotech 130-042-303
BSA Sigma Must be filter sterilized before use
Oil Red O Sigma O0625
Triethyl phosphate Sigma 538728
Whatman Paper Sigma Z241121-1PAK No. 42, Ashless. To prepare the filter fold the circular filter paper to make a semi circle, then fold the semi-circle in half again to form a cone shape. Fit the cone into a funnel for filtering. 
ProLong Gold Antifade Reagent Molecular Probes, Invitrogen P36930 This can be purchased with or without DAPI and does not quench initial fluorescence.
AxioVision Carl Zeiss Contact Zeiss
Adobe Photoshop CS5 Extended Adobe (purchased from Pugh Computers) ADPH16982* 

References

  1. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibres. J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).
  2. Hawke, T. J., Garry, D. J. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).
  3. Yin, H., Price, F., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche. Physiol. Rev. 93, 23-67 (2013).
  4. Alsharidah, M., et al. Primary human muscle precursor cells obtained from young and old donors produce similar proliferative, differentiation and senescent profiles in culture. Aging Cell. 12, 333-344 (2013).
  5. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation. J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).
  6. Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138, 3625-3637 (2011).
  7. Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter. Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).
  8. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J. Vis Exp. , e50074 (2013).
  9. Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
  10. Mackey, A. L., et al. Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies. Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).
  11. Stewart, J. D., et al. Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2. J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).
  12. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11, 231-238 (1990).
  13. Clarke, C., Davies, S., Brooks, S. A., Schumacher, U. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. Metastasis Research Protocols. 58, 17-23 (2001).
  14. Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
  15. Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
  16. Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture. J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).
  17. Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z., DiMario, J. X. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. Myogenesis. 798, 21-52 (2012).
  18. Bergström, J. Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).
  19. Chazaud, B., et al. Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth. The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).
  20. Abou-Khalil, R., et al. Autocrine and Paracrine Angiopoietin 1/Tie-2 Signaling Promotes Muscle Satellite Cell Self-Renewal. Cell Stem Cell. 5, 298-309 (2009).
  21. Timpl, R., Kvonder Mark, . Role of laminin and fibronectin in selecting myogenic versus fibrogenic cells from skeletal muscle cells in. 117, 628-635 (1986).
  22. Lichtman, J. W., Conchello, J. -. A. Fluorescence microscopy. Nat Meth. 2, 910-919 (2005).
  23. Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).
  24. Rossner, M., Yamada, K. M. What’s in a picture? The temptation of image manipulation. The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).
  25. Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience. Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).
  26. Johnson, J. Not seeing is not believing: improving the visibility of your fluorescence images. Mol. Biol. Cell. 23, 754-757 (2012).
  27. Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. The Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).
  28. Pawley, J. The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy. Biotechniques. 28, 884-887 (2000).
  29. Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224, 213-232 (2006).
  30. Brown, C. M. Fluorescence microscopy – avoiding the pitfalls. J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
  31. Bareja, A., et al. Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis. PLoS ONE. 9, e90398 (2014).
  32. Castiglioni, A., et al. Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle. Stem Cell Reports. 2, 560 (2014).
  33. Fukada, S. -. i., et al. CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice. Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).
  34. Stickland, N. Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study. J. Anat. 132, 557-579 (1981).

Play Video

Cite This Article
Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. R. Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (95), e52049, doi:10.3791/52049 (2015).

View Video