Utilizzando il Overlay saggio misurare Qualitativamente produzione batterica di sensibilità e di pneumococcico batteriocine
Summary
Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species. Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.
Abstract
Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.
Introduction
Streptococcus pneumoniae, un colonizzatore comune della comunità polimicrobica del rinofaringe, è in grado di competere con altri pneumococchi e specie strettamente collegate attraverso la produzione di peptidi antimicrobici batteri prodotte (batteriocine). Ogni ceppo pneumococcica completamente sequenziato esaminato fino ad oggi contiene una versione del b acteriocin- l ike p eptide locus, BLP. Produzione batteriocina da pneumococco ha dimostrato di essere importante nel risultato sia in vitro che in vivo la concorrenza 1-4. Dinamiche competitive sono influenzati dalla espressione di diverse batteriocine insieme a proteine immunità affini in risposta ad uno specifico peptide feromone. Induzione del locus BLP è controllato da un sistema quorum sensing in cui un peptide feromone, BlpC, si lega alla chinasi sensore, BlpH, e inizia una cascata di segnalazione conseguentetrascrizione del locus 5,6 BLP. Ci sono quattro varianti alleliche di BlpC che ogni legano alla sua BlpH cognate 6. Per la cellula di sopravvivere agli effetti della propria batteriocina, i geni che codificano le proteine immunitarie affini sono trascritti sullo stesso operone come ciascuno dei geni batteriocina. Uccidere verifica se un ceppo concorrente non è in grado di up-regolare il locus BLP in risposta a feromoni esogeno o, se il ceppo manca il gene immunità specifico richiesto per la protezione. Il complesso trasportatore, BlpAB è necessario per la secrezione e la lavorazione del feromone peptidico e peptidi batteriocina 2,4. Recentemente, è stato dimostrato che una percentuale significativa di ceppi di pneumococco sono "imbroglioni", nel senso che hanno una mutazione nel gene conservato blpA che li rende incapaci di secernere feromoni e batteriocine 1,2. Questi ceppi sono in grado di rispondere alle BlpC esogeno 2 secreta da nitritoceppi noiosi consentono la produzione di proteine di immunità.
Anche se, preparazioni crude di batteriocine da surnatanti possono essere preparati da ceppi produttori utilizzando metodi biochimici passi per raggiungere la purezza, questo approccio non è utile per lo screening di grandi collezioni di isolati e se il livello di espressione batteriocina è bassa in colture in brodo cresciuta 2,7- 9. Il saggio di sovrapposizione viene usato come un modo rapido per studiare le dinamiche competitive tra i ceppi che possono esistere in vitro. Per fare ciò, un ceppo pneumococco è pre-inoculato su una piastra di agar e ha permesso di crescere fino a raggiungere concentrazioni batteriche locali sufficienti per l'induzione del locus BLP. Un secondo ceppo viene quindi inoculato in una soluzione soft agar fuso che viene poi applicato sopra il ceppo pre-inoculato per verificare la sensibilità. Per valutare l'attività del locus BLP (indipendente da attività inibitoria), i ceppi possono essere sovrapposti con una serie di three precedentemente descritti ceppi giornalista BlpC. Questi ceppi sono stati costruiti per contenere uno dei tre diversi alleli blpH che rispondono ai tre feromoni più comuni BlpC secreti dal pneumococchi. I ceppi giornalista hanno un gene lacZ integrato che è sotto il controllo di un promotore dipendente BlpH e portare una delezione nel gene blpC che impedisce auto-stimolazione 10,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo saggio overlay è un modo rapido per determinare la gamma di attività per i produttori batteriocina e dimostrare interazioni competitive che possono verificarsi tra i ceppi di pneumococco. Il dosaggio può essere adattato overlay da utilizzare per lo screening più ceppi per la produzione batteriocine una singola piastra. Abbiamo proiettato con successo grandi collezioni di deformazione con questo dosaggio utilizzando un replicatore 48-pin per inoculare le piastre SBA da una metà di una piastra a 96 pozzetti. D…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been supported by Elizabeth E. Kennedy Research Award.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH20 autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH20 autoclave |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
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