Plano Monte imagem de Rato pele e sua aplicação à análise do folículo piloso Padronização e Sensorial Axon Morfologia

A pele é um dos maiores órgãos do corpo, com funções importantes no somato-sensação, isolamento / termorregulação e defesa imunológica ^1. Compreender a base molecular e celular do desenvolvimento da pele e função tem sido de interesse de longa data por causa da importância fundamental da pele como um sistema biológico e sua relevância para a dermatologia. Pele de mamíferos contém uma variedade de estruturas multicelulares, incluindo camadas estratificadas de queratinócitos, tecido conjuntivo dérmico, vários tipos de folículos capilares, glândulas sebáceas, músculo eretor de pêlos, vasos sanguíneos, e pelo menos uma dúzia de classes distintas de aferentes (sensoriais) e nervo eferente fibras (Figura 1). Diferentes regiões do corpo estão associadas com caracteristicamente diferentes tipos de pele. Na maioria dos mamíferos, quase toda a superfície corporal é coberta com pele que é densamente com folículos pilosos. [Os seres humanos e os ratos-toupeira pelados constituem exceções ao thé padrão.] cabelo está ausente das superfícies palmar das mãos e dos pés, que também estão associados a padrões especializados epidérmico (dermatoglyphs), as glândulas exócrinas, e terminações nervosas sensoriais. Os eventos celulares e moleculares que controlam o crescimento, diferenciação e arranjo espacial das células dentro do folículo piloso são de especial interesse como cada exposições do folículo, em miniatura, muitas das características centrais da organogênese ^2. Esses recursos incluem a existência de células-tronco e um nicho de células-tronco, as migrações celulares precisamente coreografadas, ea montagem de estruturas multicelulares a partir de componentes embriologicamente distintas.

Este artigo descreve métodos para dissecar, fixação, rotulagem, e pele do rato de imagem como uma folha bidimensional intacto, referido como um "todo monte" ou "flat montar" preparação. Desde que a pele do rato é relativamente fina, é possível para a imagem em toda a espessura de esqui achatadan, usando microscopia confocal convencional. A abordagem plana de montagem para imagiologia pele de mamíferos é tecnicamente vantajosa, pois evita a necessidade de seccionamento físico, permitindo assim que as estruturas de ser reconstruído inteiramente por seccionamento óptico. Uma vez que quase toda a pele é processado como um único objecto, o plano de montagem abordagem também facilita a criação da imagem de várias regiões da superfície do corpo, enquanto preserva as informações sobre a posição e orientação em relação aos eixos do corpo. Finalmente, as estruturas dentro da pele estão tipicamente presentes em padrões que são repetidos em intervalos regulares, facilitando assim a obtenção de imagens a partir de vários representantes de uma dada estrutura. Estas características são familiares para neurobiologists que trabalham na retina, uma peça de duas dimensões do sistema nervoso central, que goza de vantagens análogas para estudos de morfologia neuronal ^3.

A abordagem plana montar aqui descrito é de utilit especialy para o estudo das estruturas que exibem organização espacial numa escala relativamente grande dentro do plano bidimensional da pele. Um exemplo de organização espacial em larga escala é a polaridade coordenada dos folículos pilosos e as estruturas associadas ao folículo piloso – grupos de células de Merkel, músculos eretor do pêlo, glândulas sebáceas, e terminações nervosas ^4. Os folículos do cabelo são orientados com um ângulo em relação ao plano da pele, e o componente do vector de folículo, que se situa dentro do plano da 2-dimensional da pele exibe geralmente uma orientação em relação aos eixos do corpo que é determinada com precisão para cada posição sobre o corpo. Por exemplo, os folículos pilosos no ponto de volta da rostral para caudal e cabelo na superfície dorsal dos pés apontam de proximal para distal. Orientação folículo de cabelo é controlado por planar sinalização polaridade celular (PCP, também chamado de polaridade de tecido ^5). Este sistema de sinalização foi descoberto em Drosophila, onde um pequenoconjunto de genes de PCP núcleo foi encontrada para controlar a orientação dos cabelos cuticulares e cerdas. Três ortólogos de genes de mamíferos PCP fundamentais – homólogos frisado 6 (Fzd6, também conhecido como Fz6), caderina EGF LAG sete-pass G-receptor tipo 1 (Celsr1) e burro-like 2 (Vangl2) – exercer funções análogas em mamíferos pele, coordenando as orientações dos folículos pilosos com os eixos do corpo. Os estudos de camundongos knockout Fz6 (Fzd6 ^tm1Nat, doravante referida como Fz6 ^{– / -)} mostram que o defeito primário na ausência de sinalização PCP é uma randomização inicial ou desorganização da orientação folículo piloso, com nenhum efeito sobre a estrutura intrínseca dos folículos ^6-8. Um segundo sistema não-PCP age mais tarde para promover alinhamento local de folículos próximos, o que leva à produção de padrões de cabelo em grande escala, tais como espirais e tufos.

Um segundo exemplo de grande escalaorganização espacial dentro da pele é visto nas morfologias de mandris axônios sensoriais. Neurônios sensoriais que inervam a pele têm seus corpos celulares na raiz dorsal e gânglios trigeminal. Estes neurônios detectar a temperatura, dor, prurido, e vários tipos de deformações mecânicas que incidem sobre a pele e cabelo ^9. Eles podem ser divididos em subtipos baseados nas diâmetro e velocidade de condução axonal, a estrutura final do nervo terminal, e os padrões de expressão dos receptores, canais e outras moléculas. Devido à elevada densidade de inervação dentro da pele, as análises que envolvem a visualização de todos os axónios (por exemplo, a imunocoloração anti-neurofilamento) ou mesmo todos os axónios de uma classe única (como se vê quando um único tipo de célula está marcada pela expressão de um repórter fluorescente) geralmente revela uma sobreposição densa de axônios que faz com que seja impossível definir a morfologia de um mandril individual. Para contornar esse problema, temos utilizado extremamente escassa l geneticamente dirigidoAbeling para produzir amostras de pele dorsal, em que os mandris de axónios individuais bem isoladas são visualizadas através da expressão de um repórter histoquímica, fosfatase alcalina da placenta humana ^10. Esta abordagem permite a visualização não ambígua de morfologias axônio mandril individuais e uma definição de tipos de neurônios somatossensorial com base em critérios morfológicos.