Flat Mount Imaging of Mouse Hud og sin søknad til Analyse av hårsekken Mønster og Sensory Axon morfologi

Huden er en av de største organene i kroppen, med viktige funksjoner i somato-sensasjon, isolasjon / termoregulering, og immunforsvaret ^en. Forstå det molekylære og cellulære grunnlag av huden utvikling og funksjon har vært av langvarig interesse på grunn av den grunnleggende betydningen av huden som et biologisk system og dets relevans for dermatologi. Pattedyrhud inneholder en rekke flercellede strukturer, inkludert lagdelte lag av keratinocytter, dermal bindevev, flere typer hårsekker, talgkjertler, arrector pili muskler, blodårer, og minst et dusin forskjellige klasser av afferente (sensoriske) og efferent nerve fibre (figur 1). Forskjellige regioner av kroppen, er forbundet med karakteristisk forskjellige typer hud. I de fleste pattedyr, er nesten hele kroppsoverflaten er dekket med hud som er tettpakket med hårsekker. [Mennesker og nakne muldvarp rotter utgjør unntak til ther mønster.] Hair mangler fra palmar flater av hender og føtter, som også er forbundet med spesialiserte epidermal mønstre (dermatoglyphs), eksokrine kjertler, og sensoriske nerveender. Cellulære og molekylære hendelser som styrer vekst, differensiering, og romlig organisering av celler i hårsekken er av spesiell interesse som hver hårsekken utstillinger, i miniatyr, mange av de sentrale funksjonene i organogenesen ^to. Disse funksjoner inkluderer eksistensen av stamceller og en stamcelle nisje, nettopp koreografert cellevandring, og montering av flercellede strukturer fra embryologisk forskjellige komponenter.

Denne artikkel beskriver metodene for å dissekere, festing, merking, og avbildnings mus huden som en intakt todimensjonalt ark, referert til som en "hel mount" eller "flat montere" preparat. Siden muse huden er relativt tynt, er det mulig å bilde gjennom den fulle tykkelse av flat skin ved hjelp av konvensjonelle konfokalmikroskopi. Den flate mount tilnærming til bildebehandling pattedyrhud er teknisk fordelaktig fordi den omgår behovet for fysisk seksjonering, og dermed lar strukturer som skal rekonstrueres i sin helhet av optisk snitting. Siden nesten hele huden behandles som en enkelt gjenstand, flat monterings tilnærmingen muliggjør også avbildning av flere regioner av kroppsoverflaten og samtidig bevare informasjon om posisjon og orientering i forhold til kroppens akse. Endelig strukturer i huden er vanligvis til stede i mønstre som gjentas med jevne mellomrom, noe som letter oppsamling av bilder fra flere representanter for en gitt konstruksjon. Disse egenskapene er kjent for nevrobiologer som arbeider på netthinnen, en to-dimensjonal del av sentralnervesystemet som nyter analoge fordeler for studier av neuronal morfologi ^tre.

Den flate montere tilnærmingen som beskrives her er av spesiell Utility for å studere strukturer som utviser romlig organisering på en forholdsvis stor skala i løpet av de to-dimensjonale planet av huden. Ett eksempel på storskala romlige organiseringen er koordinert polaritet av hårsekkene og hårsekken-assosiert strukturer – Merkel celle klynger, arrector pili muskler, talgkjertler, og nerveender ^fire. Hårsekker er orientert med en vinkel med hensyn til planet av huden, og den komponent av hårsekken vektor som ligger innenfor det to-dimensjonale planet av huden generelt fremviser en orientering med hensyn til kroppens akse det er nettopp bestemt for hvert stilling på kroppen. For eksempel til hårsekkene på baksiden punktet fra rostral hale og hår på framsiden av føttene peker fra proksimale til distale. Hårsekken orientering styres av planar celle polaritet signale (PCP, også kalt tissue polaritet ^5). Denne signaleringssystem ble oppdaget i Drosophila der et litesett av kjerne PCP gener ble funnet til å styre retningen på cuticular hår og bust. Tre pattedyr orthologues av kjerne PCP gener – frizzled homologe 6 (Fzd6, også referert til som FZ6), cadherin EGF LAG sju-pass G-type reseptor 1 (Celsr1), og vang lignende 2 (Vangl2) – spille analoge roller i pattedyr hud, koordinere orienteringer av hårsekkene med kroppens akser. Studier av FZ6 knockout mus (Fzd6 ^tm1Nat, heretter referert til som FZ6 ^{– / -)} viser at den primære defekten i fravær av PCP signalering er en første randomisering eller uorden av hårsekken orientering, og har ingen effekt på den indre struktur av follikler ^6-8. En annen ikke-PCP systemet fungerer senere å fremme lokal justering av nærliggende follikler, noe som fører til produksjon av store hår mønstre som spinnehjul og dusker.

Et annet eksempel på storskalaromlige organiseringen innenfor huden er sett i morfologi av sensoriske axon lysthus. Sensoriske nevroner som innerverer huden har sine celle organer i dorsal root og trigeminusgangliene. Disse neuroner detektere temperatur, smerte, kløe, og forskjellige typer av mekaniske deformasjoner impinging på huden og håret ^9.. De kan deles inn i undertyper basert på axon diameter og ledningshastighet, terminal nerve slutt struktur, og mønstrene av ekspresjon av reseptorer, kanaler og andre molekyler. På grunn av den høye tettheten av innervasjon i huden, analyser som involverer visualisere alle aksoner (f.eks anti-neurofilament farging) eller til og med alle axons av en enkelt klasse (sett når en enkelt celletype er preget av uttrykk av et fluorescerende reporter) åpenbarer generelt en tett superposisjon av aksoner som gjør det umulig å definere morfologien til et individ Arbor. For å omgå dette problemet, har vi brukt svært sparsom genetisk rettet labeling å produsere rygghuden prøver hvor enkelt godt isolerte axon arbors er visualisert ved uttrykk for et histochemical reporter, human placenta alkalisk fosfatase ^10. Denne tilnærmingen gjør det entydig visualisering av individuelle axon arbor morfologi og en definisjon av somatosensoriske nevroner typer basert på morfologiske kriterier.