Flat Mount avbildning av Mouse Hud och dess tillämpning till Analys av Hårsäck Mönstring och Sensory Axon morfologi

Huden är ett av de största organ i kroppen, med viktiga funktioner i somato-sensation, isolering / värmereglering, och immunförsvaret ^1. Att förstå den molekylära och cellulära grunden för hudens utveckling och funktion har varit för långvarigt intresse på grund av den grundläggande betydelsen av huden som ett biologiskt system och dess relevans för dermatologi. Mammaliehud innehåller en mängd flercelliga strukturer, inklusive skiktade lager av keratinocyter, dermal bindväv, flera typer av hårsäckar, talgkörtlar, arrector pili muskler, blodkärl, och minst ett dussin olika typer av afferenta (sensoriska) och efferenta nerv fibrer (figur 1). Olika regioner av kroppen är associerade med karakteristiskt olika typer av hud. I de flesta däggdjur, är nästan hela kroppsytan täckt med hud som tätt är packad med hårsäckar. [Människor och nakna mole råttor utgör undantag till thär mönstret.] Hår saknas Palmar ytorna i händer och fötter, som också förknippas med specialiserade epidermala mönster (dermatoglyphs), exokrina körtlar och sensoriska nervändar. De cellulära och molekylära händelser som styr tillväxt, differentiering och rumsliga arrangemanget av celler i hårsäcken är av speciellt intresse eftersom varje follikel utställningar, i miniatyr, många av de centrala dragen i organogenesen ^2. Dessa funktioner inkluderar att det finns stamceller och stamcellsnischen, exakt koreograferade cellmigrationer, och montering av flercelliga strukturer från embryologiskt skilda komponenter.

I artikeln beskrivs metoder för att dissekera, fixering, märkning och bildhantering mus hud som ett intakt tvådimensionellt ark, kallad "hela berget" eller "flat montera" förberedelse. Sedan mushud är relativt tunn, är det möjligt att bilden genom hela tjockleken av tillplattad skidan med användning av konventionell konfokalmikroskopi. Den platta monterings metod för avbildning däggdjurshud är tekniskt fördelaktigt eftersom det kringgår behovet av fysiska sektione därigenom medge strukturer som skall rekonstrueras uteslutande genom optisk sektionering. Eftersom nästan hela huden behandlas som ett enda objekt, den platta montera tillvägagångssätt underlättar också avbildning av multipla regioner av kroppsytan och samtidigt bevara information om position och orientering i förhållande till kroppens axel. Slutligen strukturer inom huden är typiskt i mönster som upprepas med jämna mellanrum, vilket underlättar insamlingen av bilder från flera representanter för en given struktur. Dessa egenskaper är bekanta för neurobiologists som arbetar på näthinnan, en tvådimensionell del av det centrala nervsystemet som har liknande fördelar för studier av neuronal morfologi ^3.

Den platta montera metod som beskrivs här är av särskild Utility för att studera strukturer som uppvisar rumslig organisation i relativt stor skala i det tvådimensionella planet i huden. Ett exempel på storskaliga rumsliga organisation är den samordnade polaritet hårsäckar och hårsäcken-associerade strukturer – Merkel cellkluster, arrector pili muskler, talgkörtlar och nervändar ^4. Hårsäckar är orienterade i en vinkel i förhållande till planet för huden, och komponenten av follikel vektor som ligger inom det 2-dimensionella planet av huden i allmänhet uppvisar en orientering med avseende på kroppens axlar som är exakt bestämd för varje läge på kroppen. Till exempel, för att hårsäckarna på baksidan punkten från rostral kaudala och hår på den övre delen av fötterna pekar från proximalt distalt. Hårsäcken orientering styrs av plana cellpolaritet signalering (PCP, även kallad vävnads polaritet ^5). Detta signaleringssystem upptäcktes i Drosophila där en litenuppsättning centrala PCP gener befanns styra inriktningen av cuticular hår och borst. Tre mammaliska ortologer av kärn PCP gener – frizzled homologa 6 (Fzd6, även hänvisad till som FZ6) cadherin EGF LAG sju-pass av G-typ-receptor 1 (Celsr1) och vang-like 2 (Vangl2) – spela analoga roller i däggdjurs- hud, samordna riktlinjerna i hårsäckarna med kroppsaxlarna. Studier av Fz6 knockoutmöss (Fzd6 ^tm1Nat, nedan kallat FZ6 ^{– / -)} visar att den primära defekten i frånvaro av PCP signalering är en initial randomisering eller desorganisation av hårsäcken läggning, utan någon effekt på den inneboende strukturen hos folliklarna ^6-8. En andra icke-PCP systemet agerar senare för att främja lokal inriktning av närliggande folliklar, vilket leder till produktion av storskaliga hår mönster såsom virvlar och tofsar.

Ett andra exempel på storskaligarumslig organisation i huden ses i morfologier av sensoriska axon hållare. Sensoriska nervceller som innerverar huden har sina cellkroppar i dorsala och trigeminala ganglier. Dessa neuroner detektera temperatur, smärta, klåda, och olika typer av mekaniska deformationer som träffar huden och håret ^9. De kan delas in i undertyper baserade på axon diameter och ledningshastighet, terminal nervänden struktur, och de mönster av uttryck av receptorer, kanaler och andra molekyler. På grund av den höga tätheten av innervation i huden, analyser som involverar visualisera alla axoner (t.ex. anti-neurofilament immunofärgning) eller till och med alla axoner av en enda klass (som kan ses när en enda celltyp är märkt genom uttryck av en fluorescerande reporter) allmänhet avslöjar en tät lagring av axoner som gör det omöjligt att definiera morfologi av en enskild berså. För att kringgå detta problem har vi använt mycket gles genetiskt riktad lAbeling att producera dorsala hudprov där enskilda välisolerade axon arbors visualiseras genom expression av en histokemisk reporter, humant placentalt alkaliskt fosfatas ^10. Detta tillvägagångssätt gör det entydiga visualisering av enskilda axon arbor morfologier och en definition av somatosensoriska neuron typer baserat på morfologiska kriterier.