Appartamento Monte Imaging di pelle di topo e la sua applicazione alla analisi del follicolo pilifero patterning e sensoriale Axon Morfologia

La pelle è uno dei più grandi organi del corpo, con importanti funzioni somato-sensazione, isolamento / termoregolazione e difesa immunitaria ^1. Comprensione delle basi molecolari e cellulari della pelle sviluppo e la funzione è stata di interesse di lunga data per l'importanza fondamentale della pelle come un sistema biologico e la sua rilevanza per dermatologia. Pelle dei mammiferi contiene una varietà di strutture multicellulari, tra cui stratificazioni di cheratinociti, il tessuto connettivo dermico, diversi tipi di follicoli piliferi, le ghiandole sebacee, muscoli erettore del pelo, vasi sanguigni, e almeno una dozzina di classi distinte di afferenti (sensoriali) ed efferenti del nervo fibre (Figura 1). Diverse regioni del corpo sono associate caratteristicamente diversi tipi di pelle. Nella maggior parte dei mammiferi, quasi tutta la superficie corporea è coperto con la pelle che è densamente compresso con follicoli piliferi. [Gli esseri umani e talpe nude costituiscono deroghe al secoloè modello.] Capelli manca dalle superfici palmari delle mani e dei piedi, che sono anche associati con modelli specializzati epidermiche (dermatoglifi), ghiandole esocrine, e le terminazioni nervose sensoriali. Gli eventi cellulari e molecolari che controllano la crescita, la differenziazione e la disposizione spaziale delle cellule all'interno del follicolo pilifero sono di particolare interesse in quanto ogni follicolo mostre, in miniatura, molte delle caratteristiche centrali della organogenesi ^2. Queste funzionalità includono l'esistenza delle cellule staminali e una nicchia di cellule staminali, le migrazioni cellulari coreografati con precisione, e il montaggio di strutture multicellulari dai componenti embriologicamente distinte.

Questo articolo descrive i metodi per la dissezione, il fissaggio, l'etichettatura, e la pelle del mouse di imaging come un foglio bidimensionale intatta, indicato come un "tutto il monte" o "flat mount" di preparazione. Poiché la pelle mouse è relativamente sottile, è possibile immagine attraverso l'intero spessore di sci appiattitan usando la microscopia confocale convenzionale. L'approccio piatta monte all'imaging pelle del mammifero è tecnicamente vantaggioso perché evita il bisogno di sezionamento fisico, consentendo in tal modo strutture da ricostruire interamente sezionamento ottico. Poiché quasi tutta la pelle viene elaborato come un singolo oggetto, il piatto di montaggio approccio facilita anche l'imaging di più regioni della superficie del corpo, preservando informazioni sulla posizione e l'orientamento rispetto agli assi del corpo. Infine, le strutture all'interno della pelle sono tipicamente presenti nei modelli che si ripetono a intervalli regolari, facilitando così la raccolta di immagini da più rappresentanti di una data struttura. Queste caratteristiche sono familiari a neurobiologi che lavorano sulla retina, una parte bidimensionale del sistema nervoso centrale che gode di vantaggi analoghi per studi di morfologia neuronale ^3.

L'approccio montare piatto qui descritto è di utilit specialey per lo studio delle strutture che presentano organizzazione spaziale su scala relativamente grande sul piano bidimensionale della pelle. Un esempio di grande organizzazione spaziale è la polarità coordinata dei follicoli piliferi e delle strutture follicolo-associato capelli – gruppi di cellule di Merkel, muscoli muscolo piloerettore, ghiandole sebacee, e le terminazioni nervose ^4. Follicoli piliferi sono orientate ad un angolo rispetto al piano della pelle, e la componente del vettore follicolo che sia situato sul piano 2-dimensionale della pelle generalmente esibisce un orientamento rispetto agli assi del corpo che è preciso per ciascun posizione sul corpo. Ad esempio, i follicoli dei capelli sul punto di ritorno da rostrale a caudale e capelli sulla superficie dorsale dei piedi puntano da prossimale a distale. Capelli orientamento follicolo è controllato da segnali di polarità planare delle cellule (PCP, chiamato anche la polarità del tessuto ^5). Questo sistema di segnalazione è stato scoperto in Drosophila dove un piccoloinsieme di geni essenziali PCP è stata trovata per controllare l'orientamento di peli e cuticolare setole. Tre orthologues mammiferi di geni fondamentali PCP – omologhi frizzled 6 (Fzd6, noto anche come FZ6), caderina EGF LAG sette-pass G-recettore tipo 1 (Celsr1), e vang-like 2 (Vangl2) – svolgono ruoli analoghi in mammiferi pelle, coordinando gli orientamenti dei follicoli dei capelli con gli assi del corpo. Studi di FZ6 topi knockout (Fzd6 ^tm1Nat, di seguito denominato FZ6 ^{– / -)} mostrano che il difetto primario in assenza di segnalazione PCP è una randomizzazione iniziale o disorganizzazione dell'orientamento follicolo pilifero, senza alcun effetto sulla struttura intrinseca dei follicoli ^6-8. Un secondo sistema non-PCP agisce successivamente per favorire l'allineamento locale di follicoli vicini, che porta alla produzione di grandi schemi per capelli come spirali e ciuffi.

Un secondo esempio di grande scalaorganizzazione spaziale all'interno della pelle è visto nelle morfologie di pergole assoni sensoriali. Neuroni sensoriali che innervano la pelle hanno i loro corpi cellulari nella radice dorsale e gangli del trigemino. Questi neuroni rilevano temperatura, dolore, prurito, e vari tipi di deformazioni meccaniche che influiscono sulla pelle e capelli ^9. Essi possono essere suddivisi in sottotipi in base diametro dell'assone e velocità di conduzione, struttura terminale del nervo finale, e gli schemi di espressione dei recettori, canali e altre molecole. A causa della elevata densità di innervazione all'interno della pelle, analisi che coinvolgono visualizzare tutti assoni (ad esempio, immunocolorazione anti-neurofilamenti) o anche tutti assoni di una singola classe (come visto quando un singolo tipo di cellula è marcata mediante espressione di un reporter fluorescente) generalmente rivela una fitta sovrapposizione di assoni che rende impossibile definire la morfologia di un individuo Arbor. Per aggirare questo problema, abbiamo utilizzato molto radi geneticamente diretto lAbeling per produrre campioni di pelle dorsali in cui i singoli pergole assone ben isolate sono visualizzabili da espressione di un giornalista istochimica, fosfatasi alcalina placentare umano ^10. Questo approccio permette la visualizzazione inequivocabile delle singole morfologie assone pergolato e una definizione dei tipi di neuroni somatosensoriali sulla base di criteri morfologici.