Summary

Imágenes in vivo de Óptica de Fibras Nerviosas Integridad de la RM con contraste en ratones

Published: July 22, 2014
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Summary

Este video muestra un método, utilizando una clínica 3 T escáner, por contraste mejorado la RM del ratón proyección visual ingenuo y para estudios repetitivos y longitudinales en vivo de la degeneración del nervio óptico asociadas con lesión por aplastamiento del nervio óptico aguda y degeneración del nervio óptico crónica en ratones knock-out (KO p50).

Abstract

El sistema visual roedor abarca las células ganglionares de la retina y sus axones que forman el nervio óptico para entrar en los centros talámicos y del cerebro medio, y proyecciones postsinápticos a la corteza visual. Sobre la base de su estructura anatómica distinta y la accesibilidad conveniente, se ha convertido en la estructura favorecida para los estudios sobre la supervivencia neuronal, la regeneración axonal, y la plasticidad sináptica. Los recientes avances en la RM han permitido la visualización in vivo de la parte retino tectal de esta proyección utilizando manganeso mediada aumento del contraste (MEMRI). A continuación, presentamos un protocolo MEMRI para ilustración de la proyección visual en ratones, mediante el cual las resoluciones de (200 m) 3 se puede lograr utilizando escáneres comunes 3 Tesla. Demostramos cómo la inyección intravítrea de una sola dosis de 15 nmol MnCl2 conduce a una mejora de la proyección saturada intacta dentro de 24 horas. Con excepción de la retina, se indepen cambios en la intensidad de la señaldente de la estimulación visual coincidió o envejecimiento fisiológico. Aplicamos aún más esta técnica para supervisar longitudinalmente degeneración axonal en respuesta a la lesión aguda del nervio óptico, un paradigma por el que Mn 2 + transporte completamente detenciones en el sitio de la lesión. Por el contrario, el transporte activo de Mn + 2 es cuantitativamente proporcional a la viabilidad, el número y la actividad eléctrica de las fibras de axones. Para un análisis de este tipo, ejemplificamos Mn 2 + cinética de transporte a lo largo del camino visual en un modelo de ratón transgénico (p50 NF-kB KO) mostrando atrofia espontánea de los sentidos, incluyendo visuales, proyecciones. En estos ratones, MEMRI indica reducida pero no retardada Mn 2 + de transporte en comparación con ratones de tipo salvaje, lo que revela signos de alteraciones estructurales y / o funcionales por mutaciones NF-kB.

En resumen, MEMRI puentes convenientemente en ensayos in vivo y post mortem para la histología characterizatisobre la integridad y la actividad de las fibras nerviosas. Es muy útil para los estudios longitudinales sobre la degeneración axonal y la regeneración, y las investigaciones de los ratones mutantes para fenotipos genuinos o inducibles.

Introduction

Sobre la base de su estructura neuro-anatómico favorable el sistema visual del roedor ofrece posibilidades únicas para evaluar compuestos farmacológicos y su capacidad para mediar en la neuroprotección 1 o efectos pro-regenerativas 2,3. Por otra parte, permite que los estudios sobre las características funcionales y neuro-anatómico de ratones mutantes, en fecha tan reciente ejemplifica para los ratones que carecen de la proteína de andamiaje presináptico Fagot 4. Además, un amplio espectro de herramientas complementarias ofrece que ofrece adicional de células de la retina ganglio (RGC) y los números de los axones de CGR así como la actividad de RGC, por ejemplo, por el electrorretinograma y pruebas de comportamiento, y la determinación de los reordenamientos corticales por imagen óptica de señales intrínsecas. Las últimas novedades técnicas en microscopía láser permiten una visualización in situ de regeneración RGC por imágenes de fluorescencia de tejido profundo en el conjunto de montaje de especímenes del nervio óptico (NO) y el cerebro. En este histopatología,enfoque ical, tetrahidrofurano basado claro tejido en combinación con hoja de luz de microscopía de fluorescencia permite la resolución de las fibras individuales que se vuelva a introducir en el SOBRE deafferented y el tracto 5 óptica. Si bien tales técnicas pueden ser superiores en la resolución y la determinación de los patrones de crecimiento, que no permiten análisis repetitivos y longitudinales de los eventos individuales de crecimiento, que son particularmente deseables para evaluar el proceso de regeneración a largo plazo.

Mejorada de contraste de RM ha sido empleado para la visualización mínima invasiva de la proyección retino-tectal en ratones y ratas 6,7. Esto puede lograrse mediante la entrega intraocular directa de iones paramagnéticos (por ejemplo, Mn 2 +) a células de la retina. Como un análogo de calcio, Mn 2 + se incorpora en RGC somata a través de canales de calcio dependientes de voltaje y transportados activamente a lo largo del citoesqueleto axonal del EN intacto y tracto óptico. Mientras se acumula en núcleos cerebralesde la proyección visual, es decir, el núcleo geniculado lateral (LGN) y colículo superior (SC), la propagación transsynaptic en la corteza visual primaria parece insignificante 8,9, aunque puede ocurrir 10,11. Bajo secuenciación MR, paramagnético Mn 2 + aumenta el contraste MR principalmente por el acortamiento T1 spin-red tiempo de relajación 12. Tal Mn 2 + mejorado MRI (MEMRI) ha sido aplicado con éxito en varios estudios de neuro-anatómicas y funcionales de las ratas, incluida la evaluación de la regeneración axonal y degeneración después de la lesión SOBRE 13,14, el mapeo anatómico preciso de la proyección de 15 retino tectal , así como la determinación de las características de transporte axonal después del tratamiento farmacológico 16. Mejoras recientes en la dosis, la toxicidad, y la cinética de los protocolos de RM neuronales Mn 2 + captación y el transporte, así como la mejora han extendido su aplicación a los estudios sobre transgénicos9 ratones utilizando escáneres de 3 Tesla de uso común en la práctica clínica 17.

Aquí, se presenta un protocolo adecuado para MEMRI longitudinal de imágenes in vivo del ratón proyección retino tectal y ejemplificar su aplicación mediante la evaluación de mejora de la señal de Mn 2 + dependientes en condiciones de neurodegeneración ingenuos y varios. Nuestro protocolo pone especial énfasis en la adquisición de datos de RM en un campo magnético moderado 3 T, que generalmente es más accesible que los escáneres de los animales dedicados. En los ratones no tratados previamente, se expone cómo la intensidad de señal del tracto específico puede ser sustancialmente y reproducible convertirse aumentado después intravítrea (ivit) Mn 2 + aplicación. Cuantitativamente, Mn 2 + de propagación a lo largo de la proyección visual se produce independientemente del proceso de envejecimiento normal (medida entre los ratones 3 y 26 meses de edad) y el aumento es refractario a la estimulación visual y la adaptación a la oscuridad. En contraste, Mn <shasta> 2 + enriquecimiento en los centros talámicos y cerebro medio se reduce siguientes efectos agudos EN lesión por aplastamiento 18, así como en NFKB1 ratones knock-out (KO p50) que sufren de la muerte de las CGR apoptosis espontánea y la degeneración de 19. Por lo tanto, en la expansión a análisis histológico convencional, el análisis de MEMRI longitudinal de animales individuales permite perfiles de la cinética únicas de procesos neurodegenerativos. Esto puede ser muy útil para los estudios sobre la neuroprotección y la regeneración axonal asociada con las intervenciones farmacológicas o genéticas.

Protocol

Todas las intervenciones de los animales se realizaron de acuerdo con el Convenio Europeo para la Atención Animal y Uso de Animales de Laboratorio y la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research. Todos los experimentos son aprobados por el comité de ética local. El procedimiento de la lesión en ON en los ratones se describe en otro 9. 1. Intravítreas de manganeso Inyección Realice el Mn 2 + de la inyec…

Representative Results

La capacidad de esta técnica de imagen para evaluar con precisión la vitalidad y funcionalidad de la proyección visual se basa en la aplicación precisa de un no tóxico Mn 2 + dosificación al cuerpo vítreo y su absorción por las CGR. Esta suposición principal se prueba en la Figura 1, donde la capa específica de Mn 2 + captación se demuestra por autometalografía (tinción TIMM) 21. Retina secciones se analizaron a las 24 horas después de la aplicación de cua…

Discussion

MEMRI del sistema visual se extiende técnicas neurobiológicos convencionales para evaluar la funcionalidad en condiciones no tratados previamente y patológicos. Además de proporcionar una visión única de la integridad de un hecho aislado CNS tracto de fibras, MEMRI puede ser fácilmente complementado con pruebas de comportamiento, por ejemplo, optometría y tareas a base de agua visualmente, para investigar las consecuencias inmediatas de un determinado paradigma de la percepción visual. También vincula…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

AK es apoyado por la Fundación Oppenheim y RH con el apoyo de la Fundación Velux. Agradecemos I. Krumbein de técnica y K. Buder apoyo histológico, y J. Goldschmidt (Instituto Leibniz de Neurobiología, Magdeburg, Alemania) para el asesoramiento técnico en la tinción de TIMM.

Materials

Manganese (II) chloride solution 1M Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany M1787 MEMRI contrast reagent
Conjuncain Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 7617666 0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany PZN 3820927 3 mg/ml ofloxacin
Ointment panthenol Jenapharm, Jena, Germany PZN 3524531
Chloral hydrate  Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany C8383 420-450 mg/kg body weight
Isoflurane Actavis, Munich, Germany PZN 7253744
Hamilton syringe  Hamilton Company, Reno, NV, USA 7634-01 SYR 5 µl, 75 RN, no NDL
34 G  needle (34/35/pst4/tapN) Hamilton Company, Reno, NV, USA 207434/00 removable needle RN, 34 gauge, lenght 38.1 mm, point style 4
Binocular Stemi-2000 Zeiss, Oberkochen, Germany
3T MRI scanner Magnetom TIM Trio Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany
Rat head coil Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
Mouse holder custom made
Red light lamp
Frozen section medium NEG-50 Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germany 6502 tissue embedding for cryo-sections
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4) Merck, Darmstadt, Germany 106346 for sulfide perfusion 
Sodium sulfide nonahydrate (Na2S × 9 H2O) Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany 208043
gum arabic Roth, Arlesheim, Switzerland 4159 for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2) Roth, Arlesheim, Switzerland 3586
Citric acid (C6H8O7) Roth, Arlesheim, Switzerland 6490
Tri-sodium citrate dihydrate (C6H5Na3O7 x 2H2O) Merck, Darmstadt, Germany 106448
Silver nitrate (AgNO3) Roth, Arlesheim, Switzerland 7908

References

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Cite This Article
Fischer, S., Engelmann, C., Herrmann, K., Reichenbach, J. R., Witte, O. W., Weih, F., Kretz, A., Haenold, R. In vivo Imaging of Optic Nerve Fiber Integrity by Contrast-Enhanced MRI in Mice. J. Vis. Exp. (89), e51274, doi:10.3791/51274 (2014).

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