高通量筛选RNA病毒的广谱化学抑制剂

RNA病毒负责了大量的各种人类感染，并同时拥有在公共健康和经济成本方面对全世界的人口产生巨大的影响。有效的疫苗已经开发了针对几个人RNA病毒，并且被广泛地用作预防性治疗。然而，仍然有严重缺乏的治疗药物抗RNA病毒的感染。事实上，有效的疫苗不提供对主要的人类病原体，如登革热病毒，丙型肝炎病毒或人类呼吸道合胞病毒（hRSV的）。此外，RNA病毒是负责大部分新出现的疾病，它已经在频率，因为全球性的交流和对生态系统人为的影响，增加的。针对代表RNA病毒这一威胁，我们的治疗阿森纳是极其有限的，相对低效的^1-3。目前的治疗方法基本上都是基于重组I型干扰素（IFN-α/β），以刺激先天性免疫，或利巴韦林的管理。虽然这核苷类似物的作用方式是有争议的，可能依赖于各种机制，细胞IMPDH（次黄嘌呤核苷酸脱氢酶），这耗尽细胞内GTP池的抑制作用，显然是必要的^4。利巴韦林，与聚乙二醇化干扰素-α结合，是对丙型肝炎病毒的主要治疗手段。然而，IFN-α/β和利巴韦林治疗的疗效是比较差在体内对大多数RNA病毒的，因为它们通过毒力表达的有效钝的IFN-α/β信号因子⁵和经常逃避利巴韦林^3。这增加了一个事实，即利巴韦林治疗是提高重要的毒性问题，尽管它最近被批准对严重hRSV的疾病，有争议的好处^6。最近，一些病毒特异性治疗方法已被销售，特别是对流感病毒与发展Õf神经氨酸酶抑制剂^3。但是，大的多样性和RNA病毒的出现永久排除了对他们在一个相对紧密的未来每一个具体的治疗方法的发展。总之，这强调需要有效的战略，以确定并开发强大的抗病毒分子在不久的将来。

这是微不足道的说，一个广谱抑制剂有效对抗RNA病毒大面板会解决这个问题。虽然这样的分子仍然是一个病毒学家的梦想，我们更好地了解细胞防御机制和先天免疫系统表明，一些可能性存在^7,8。几个学术和工业实验室正在寻求刺激的细胞防御机制或代谢途径钝病毒复制的特定方面的分子。虽然这种化合物可能会显示出显著的副作用，对急性病毒感染的治疗会辖编为一相对短的时间，使得即使在长期的一些潜在毒性他们可以接受的。各种策略已经被开发，以识别这样的广谱抗病毒药分子。一些研究项目旨在寻找针对特定抗辩或代谢途径的分子。这包括，例如，病原体识别受体诱发的抗病毒基因的表达和⁹激活抗病毒因子如引入RNaseL ^10，自噬机械，以促进病毒降解^11，核苷合成途径^12,13，或凋亡级联反应以沉淀病毒感染细胞的死亡^14。其他小组已经开发出不是目标为基础^13,15-17表型的屏幕。在这种情况下，抗病毒分子通过它们的能力简单地识别，以阻止病毒复制的一个给定的蜂窝式系统中。一般的假设是，抑制2-3无关RNA病毒的化合物，将有一个合适的模式为广大-SPectrum抗病毒分子。有这样的经验方法选择的命中化合物的作用方式只是在第二次确定的，最终，可能导致新的细胞目标的识别抗病毒药物。有趣的是，1999年和2008年间获得美国食品药品监督管理局新药的回顾性分析表明，在一般情况下，这种表型筛查往往表现比目标为基础的方法更好地发现先入类小分子药物¹⁸ 。

在高通量的基于细胞的测定病毒的复制通常由病毒致细胞病变效应测定。细胞被感染并培养在96 – 或384 – 孔板中测试的化合物的存在。之后的几天，细胞层被固定和染色的染料如结晶紫。最后，吸光度用酶标仪和化合物抑制病毒复制是由它们的能力确定为往复保存细胞层确定米病毒诱导的细胞病变效应。另外，病毒介导的细胞病变效应正在使用标准的可行性分析，如MTS减少评估。此类测定法是高度易处理的和具有成本效益的，但三个主要的限制受到影响。首先，它们需要一个病毒-细胞组合，其中病毒的复制是细胞病变中只有几天，但情况并非总是可能的，从而要求替代方法^19。其次，他们都缺乏定量的，因为它们是基于对病毒复制的间接测量。最后，有毒化合物可以评价为阳性命中，并且因此必须与一个计数器屏幕测定细胞活力来消除。要克服一些障碍，重组病毒或复制子已设计通过反向遗传学表达报告蛋白，如绿色荧光蛋白或荧光素酶，由一个附加的转录单位或以帧为与病毒蛋白的基因（几个例子是^20-23）。当这些病毒的复制，记者公关oteins与病毒蛋白本身产生在一起。这提供了一个非常定量测定来测量病毒的复制和评估候选分子的抑制活性。这是用于重组病毒表达荧光素酶（或生物发光能力的其他酶），因为此报告系统显示出一个很宽的动态范围内具有高灵敏度，几乎没有背景，尤其如此。此外，不存在激发光源，从而防止干扰化合物的荧光^24。

在这里，我们详细地高通量协议来筛选的RNA病毒的广谱抑制剂，化学文库。化合物在感染了重组麻疹病毒（MV）表达萤火虫荧光素酶^{25（rMV2/Luc，} 如图1所示 ，主要画面）人体细胞先进行测试。 MV属于Mononegavirales秩序，往往被视为负链RNA病毒的原型成员ES。因此，MV的基因组作为模板，通过病毒聚合酶合成mRNA分子对病毒蛋白质进行编码。在重组MV株称为rMV2/Luc，萤光素酶表达是由P和M基因（ 图2A）之间插入一个附加的转录单位表达。平行地，化合物使用的是商业荧光素酶为基础的试剂，用于评估，由ATP定量测试它们的毒性对人体细胞，代谢活性细胞中培养的数量（ 图1，主屏幕）。整个化学文库可以很容易地筛选出与这两个试验，以便选择是没有毒性的，有效地阻止MV复制的化合物。然后，点击是重新测试剂量-反应抑制的MV复制，缺乏毒性以及其对损害基孔肯雅病毒（CHIKV）复制（ 图1，二次屏）的能力。 CHIKV是披膜病毒科家族的成员，其基因组是apositive单链RNA分子。因此，它是完全无关的麻疹和化合物抑制两个MV和CHIKV站在一个很好的机会，以抑制RNA病毒大面板。 CHIKV非结构蛋白是直接从病毒基因组的转化，而结构蛋白是由转录和一个亚基因组mRNA分子的翻译编码。对CHIKV我们的体外复制的测定是基于重组菌株称为CHIKV /韧，它通过NSP3和NSP4序列^26（ 图2B）之间的报告基因的插入表达的Renilla荧光素酶作为非结构性多蛋白的裂解的部分。海肾荧光素酶活性的度量允许病毒复制的监视在CHIKV生命周期的早期阶段。

这种高通量的协议被用于快速识别化合物在10000 molec商业库一个合适的模式为广谱抗病毒药物ULES丰富的化学多样性。化合物基本上按照五个平斯基的规则，分子量范围从250至600道尔顿，和日志D值低于5。大多数这些分子分别在其他商业库无法使用新的化学实体。