本体感觉和张力感受器在蟹四肢：学生实验室练习

1。解剖和记录电活动从Propodite-dactylopodite（PD）的神经从后面握住整个蟹头胸甲，并避免爪，捏钳的meropodite的近端部分。腿会autotomize以防止动物流血过多而死。处理蓝蟹的时候，因为他们是相当积极的，非常快，请小心。 图1，首先走了蟹的腿 。 chordotonal器官（阴影区域）的解剖位置叠加在这个示意图。 。双箭头表示从哪里横切腿的PD神经实验点此查看大图 。 使propodite和carpodite之间的切割。丢弃carpopodite和t他重视meropodite（ 图1）。 削减与一个＃11刀片（ 图2和图3）注意手术刀的propodite的色素（横向）边一个大窗口，角质层：不要切深。 由下方滑动的手术刀刀片拆除角质层和平行于角质层。这切断附着在角质层的肌肉纤维。 使用相同的技术削减了pigmentless的propodite的（内侧）一侧较小的窗口，但保留髁（插座接头或分部之间的铰链）连接完好。 图2沿上propodite虚线剪下 。 点击这里查看大图 。 N“SRC =”/ files/ftp_upload/51050/51050fig3.jpg“宽度=”500px的“/> 图3：暴露在窗口中的神经（箭头勾勒 ​​出神经束）。 点击这里查看大图 。 制备含蟹生理盐水断引脚制备的Sylgard林立盘注：参看表1种特定盐水食谱。 通过与火抛光玻璃针小心地探测定位在PD的器官。的弹性绞合线，横跨关节具有银色外观。 除去肌纤维，来自腱的两侧遮住了器官的视图。要非常小心，不要伤到PD的机关及其神经。 一旦这项工作完成，重新连接牢固编制朝上（ 图4）的菜与颜料侧（外侧）。 <img alt="图4" fo:content-width="“5英寸”SRC" > 图4。外露的PD器官和神经 。 点击这里查看大图 。 遵循propodite PD的器官如神经近端远越好，以腾出一长段神经（1.5厘米）记录的目的。这是最好的做法，而PD的神经仍连接到主腿部神经。 用玻璃针的帮助下分离主腿部神经PD的神经后，近端切断PD的神经与虹膜剪注意：在解剖过程中，不要拉长或拉的神经。 移动dactylopodite来扩展和完全屈曲位。注意到关于那里的极端屈伸位置是和一个中间点，供以后使用。 将接地线盐水浴内。 打开电子lectrophysiology记录硬件/软件注：我们的设置以前已经23描述。 放置显微镜，使其俯瞰显微镜载物台。一旦准备盘放置在舞台上，你将需要调整的高强度照明光束的位置，以最佳的可视化的准备。 定位显微操纵器，以便连接的吸电极组件将很容易获得的盐水浴和准备。抽吸电极的构造如图在线视频24。 以检测神经活动，画出PD神经的切断端插入抽吸电极。 将长短格整个几个周期与玻璃探头或木榫的帮助扩展和弯曲位置。 接着观察活动时的长短格被固定在延长，弯曲，和中间的位置。 2。从张力记录电活动神经同时监测部队产生确定腿的外侧和内侧。内侧具有柔软的手感，可以通过用指甲轻轻夹持在meropodite区域被感觉到。 把这个柔软的角质层一面朝上的菜。该励磁电机的神经支配的肌肉的揭幕战也支配的carpopodite担架肌肉。 为了刺激开瓶器肌肉的拉伸运动神经在carpodite区域分离并与抽吸电极刺激。腿的近端部分被横切meropodite用剪刀除去。 去除角质层中的腕区域的部分的内侧（内侧， 图5A）。 切弯肌肉的apodeme并小心地取出肌肉不拉主力腿神经出腿腔（ 图5B，C注意箭头在哪里德尔apodeme分离）。主要的腿神经和胸罩NCH ​​到担架肌肉然后可以观察到（ 图5D）。 找到神经从主神经束分支到担架肌肉（ 图5E中，在箭头所示），这可切割靠近肌肉和拉入抽吸电极刺激（ 图5F和G，箭头示出了分支）。 梳理出神经的部分，伸向了​​开门红，而不会挤压神经。横切担架/首战运动神经。 拉运动神经进入抽吸电极，然后刺激它。 揭露首战肌肉和紧张的神经去除接近肌和propodite的腹侧区域。切断与一个＃11刀片在propodite（ 图6）手术刀越接近肌肉注：不要深深地砍在近端区域，因为它可能会损坏首战运动神经。 <img alt="图5" fo:content-width ="“5英寸”SRC" > 图5。解剖步骤露出运动神经元对刺激的揭幕战肌肉 。 点击这里查看大图 。 图6。削减角质层的propodite，露出接近的肌肉，因此它可以被删除的腹侧半 。 点击这里查看大图 。 换用新鲜冷却液的生理盐水整个解剖过程中，以保持神经元的存活。如需进一步解剖，将准备的菜在解剖显微镜下，用光纤照明。 小心地从它的附件削减接近肌腱使用尖锐中型剪刀长短格。 要非常小心，不要从主腿部神经应该是清晰可见的打扰跳转到揭幕战的肌肉。 取下并扔掉接近肌肉和肌腱。 使在长短格一个孔用解剖针。该孔将在后面用来勾上的张力（力）换能器的金属销，但有必要使其在这一阶段的程序。 找到神经分支投射到揭幕战肌肉和apodeme在揭幕战中肌肉的远端区域。仔细探查神经与火抛光玻璃的工具。 观察神经张力所产生的apodeme并且前进到运动神经束的前端。 为了检测神经活动，填补吸电极与蟹生理盐水并绘制揭幕战的紧张神经的切断端插入电极。确保吸入电极紧密配合的神经。 检查为神经氨酸升被动张力开门红apodeme的相关性。同时记录电活动从紧张的神经，迅速 ​​旋转长短格成一个扩展接头（ 即拉伸开门红肌肉）。 接下来，测试的积极力量发展有关的刺激频率。 牢固附着的金属挂钩，这样的梭尖穿过一个小孔长短格。 ，附加的金属钩的另一端连接到力传感器注意：确保换能器在一个90°角的每个时间，使该引脚为垂直于传感器的最大检测所产生的力。 拉动钩和长短格，以便它在约45°的开瓶器关节的角度。 现在，刺激运动神经，在100赫兹为250毫秒，测量力和张力神经的发射频率。 将联合到一个完全伸出的位置，使得开启者的肌肉纤维松弛。 Stimulate运动神经在100 Hz时250毫秒，测量力和张力神经的发射频率。 弯/弯曲的关节，以便它完全弯曲（〜90°）。在这个位置上揭幕战的肌肉纤维得到充分拉伸。有可能是由换能器由于这种被动拉伸肌肉的测量一些力。 刺激运动神经，在100赫兹为250毫秒，测量力和张力神经的发射频率。 测量力后，进行了一系列不同频率的：20，40，60，80，100赫兹为8-10秒，每个关节的位置。 衡量一个快速释放紧张的反应。安排的制备使得在力传感器的钩子可以容易地推压在长短格孔出来。 弯/弯曲的关节，以便它完全弯曲（〜90°）。现在，刺激运动神经，在100赫兹，5秒的持续刺激。 第一次生后d以下，由于工作紧张已建立了上揭幕战的肌肉，推动销出的长短格孔。 之前和之后的针保持的长短格的释放研究神经张力的记录。 的神经活性物质，如章鱼胺，五羟色胺，和proctolin，这改变了张力的神经元的输出的调节作用，可以通过添加这些分子以入浴介质在暴露的开瓶器肌肉和重复实验来确定。 用移液管和在准备滴1-2毫升。 3。染色外周神经系统结构的甲壳步足 亚甲蓝技术 稀释1部分的亚甲基蓝氯化物溶液（0.25％）与蒸馏水两部分。 加入此混合物中，以5份缓冲盐水。彻底冲洗感兴趣的区域。 根据第1条的协议剖析了一条腿。孵育前paration中的亚甲基蓝溶液在12-13°C。 检查制剂每10-15分钟，用低强度照射，以遵循染色的进度解剖显微镜。在某些情况下，染色会在一小时内完成，在别人可能需要过夜。 4 -二-2 – ASP技术 荧光染料可用于回填的帕金森病的神经元，或者直接从浴中染色的制备。然而合适的显微镜的能力，以查看该荧光染料是必需的。 根据第1条的协议剖析了一条腿。 孵育的制备在4 – 二-2 – ASP溶液10μM的浓度，并使制剂在冰箱中15分钟。使用适量的解决方案涵盖了准备。 快速拍摄的准备工作，避免过度暴露于汞的光。这种荧光染料消失相对较快。 <li> 氯化钴技术 根据第1条的协议暴露PD的神经，并保持它浸在冷盐水。 使凡士林以及持有氯化钴。如果有任何氯化钴泄漏到盐水浴的全部准备工作将弄脏的黑色，并准备应该被丢弃。 滑的聚苯乙烯片材的一个小切口，以使一个塑料平台，并针它以这样一种方式，它不会漂走或成为浸渍在盐水浴（ 图7）。 图7。聚苯乙烯板材用大头针在地方举行的菜 。 点击这里查看大图 。 从细皮下注射针头固定到一次性注射器喷出凡士林，然后做一个屏障（一个圆可能会很好地工作），这应该是大约1-1.5毫米高，除去浅“V”在中点所在的神经会被披上跨越，对聚苯乙烯的滑之上。 使盐水对附近的“V”形的屏障两侧的小水坑。注意不要拉伸或挤压神经，从盘中仔细解除神经，并将其放置在石油生理盐水水坑果冻很好。 工作迅速，使神经节不干涸，仔细弹出凡士林，以覆盖外露的神经。现在测试用生理盐水障碍，并确保它不被泄漏。 吸干了盐水在闸厢内侧，看看它填补了洗澡的时候生理盐水是围绕高凡士林的墙上，以确保双方彼此（ 图8）隔离。 <stro ng>图8。 凡士林很好用生理盐水和PD神经跨越好 。 PD的神经还没有被切断呢。 点击这里查看大图 。 吸走生理盐水中使用的是一块纸巾井。避免让纸包裹的神经。 创建一个新的水坑运用的几个小滴蒸馏水，然后切神经末梢。要非常小心，不要穿过屏障使切口拉出时神经。蒸出的水的渗透休克将“气球”的轴突。 在30秒内加一小滴氯化钴的水中，浸泡了该解决方案，然后添加足够的氯化钴，形成一个水坑在神经（ 图9），这缩短的部分。准备最好保持冷藏在13℃下12-24小时。 tp_upload/51050/51050fig9.jpg“宽度=”500px的“/> 图9。切割PD的神经暴露于氯化钴 。切断神经肿起来的水的存在，通过轴突成神经元细胞体推动并加快了染料分子的运动。 点击这里查看大图 。 拆下加湿水坑。吸干了使用组织的钴溶液洗去钴的残余盐水的一些变化。 隔离准备转移到含约10ml生理盐水蟹的小玻璃培养皿。的神经元进行洗涤，以下步骤在原位进行。良好的金属工具不被用于处理在此步骤之后的制备（应使用特定的工具，并不在稍后的时间为生理学被使用）。 加1-2滴硫化铵（NH4）2 S的盐水。盖上（NH 4）2 S瓶紧紧地放置回罩。观察解剖显微镜下的准备反应在1-2分钟，钴充满神经元及其过程应该开始出现，因为它们会弄脏的黑色。 经过5-10分钟，更换新鲜生理盐水开发解决方案。 请确定您已经倒入水槽排水的开发解决方案，其次是流动的自来水几分钟或浪费，瓶子，盖子。 倒出盐水和修复神经准备用Bouin氏液固定剂两种变化约15分钟。对于像揭幕战肌肉组织较大（染色紧张的神经元），增加固定的持续时间30分钟。 脱水在一系列乙醇浓度开始在70％（ 即 70％，80％，90％，100％）按升序排列。约10分钟，在各浓度足以小的组织。 后在100％乙醇的两个变化约10-15分钟，清除组织了100％水杨酸甲酯代替乙醇。准备将留在这个解决方案为永久重复观看。随着时间的填充单元将变得更加明显，因为周围组织将变得更加清晰。强化方法可以用来帮助防止褪色随着时间的推移25。 使用相同的过程，填补了紧张的神经与氯化钴。然而，改变乙醇溶液多次在每个乙醇脱水步骤，并培育内酒精的准备工作约20分钟每步彻底脱水的肌肉，让他们清楚好。