Um protocolo estruturada é apresentado para um ensaio de base celular como um teste funcional para prever o prognóstico de escoliose idiopática usando espectroscopia dieléctrica celular (CDS). O ensaio pode ser realizado com as células mononucleares do sangue periférico frescos ou congelados (PBMC) e o procedimento for concluído no prazo de 4 dias.
Este protocolo detalha o procedimento experimental e analítico para um ensaio baseado em células desenvolvido em nosso laboratório como um teste funcional para prever o prognóstico de escoliose idiopática em crianças assintomáticas e afetados. O ensaio consiste na avaliação do estado funcional das proteínas Gi e Gs em células mononucleares do sangue periférico (PBMC) por espectroscopia dielétrica celular (CDS), utilizando um instrumento baseado em CDS automatizado, bem como a classificação das crianças em três grupos funcionais (FG1 , FG2, FG3) no que diz respeito ao perfil de desequilíbrio entre o grau de resposta a Gi Gs e proteínas de estimulação. A classificação é ainda confirmada pelo efeito diferencial da osteopontina (OPN) em resposta à estimulação Gi entre os grupos ea progressão grave da doença é referenciado por FG2. Aproximadamente, um volume de 10 ml de sangue é necessário para extrair PBMC por gradiente de Ficoll-e as células são então armazenadas em azoto líquido. O número adequado de PBMCs para realizar o ensaio é obtido após dois dias de cultura de células. Essencialmente, as células são primeiro incubadas com phytohemmaglutinin (PHA). Após 24 horas de incubação, o meio é substituído por um meio de cultura isento de PHA durante mais 24 horas adicionais antes da sementeira celular e tratamento de OPN. As células são então espectroscopicamente selecionados para suas respostas a somatostatina e isoproterenol, que, respectivamente, ativam proteínas Gi e Gs através de seus receptores cognatos. Ambos somatostatina e isoproterenol são injectados simultaneamente com um sistema de fluidos integradas e respostas das células são monitorizados durante 15 min. O ensaio pode ser realizado com PBMC frescos ou congelados e que o processo for concluído dentro de 4 dias.
Escoliose idiopática é uma deformidade da coluna de causa desconhecida, geralmente definida como uma curvatura lateral maior do que 10 graus, acompanhadas por uma rotação vertebral 1. A condição afeta 4% da população pediátrica e é mais comumente diagnosticado entre as idades de 9 a 13 anos 2,3,4. O diagnóstico é primariamente de exclusão e é feita somente após a exclusão de outras causas de deformidade da coluna vertebral, como a malformação vertebral, neuromuscular ou doenças sindrômicas. Tradicionalmente, a assimetria trunkal é revelado por Adams teste frente de flexão e medido com escoliômetro durante o exame físico 5. O diagnóstico pode ser confirmado por observação radiográfica da curva e a medição do ângulo, utilizando o método de Cobb 6.
Uma vez diagnosticada, a principal preocupação para os médicos no tratamento de crianças com escoliose é se a curva vai progredir. Com efeito, a progressão da curva é frequentemente imprevisível eé mais freqüentemente observada entre as meninas do que em meninos 7. Se não for tratada, a curva pode progredir drasticamente, criando deformidade física significativa e até mesmo problemas cardiopulmonares. Estas manifestações se tornar fatais quando a curva for superior a 70 ° 8,9. As opções atuais de tratamento para prevenir ou impedir a progressão da curva incluem órtese e cirurgia. Em geral, se preparando é recomendada para curvas entre 25-40 °, enquanto a cirurgia é reservada para as curvas superiores a 45 ° ou que não respondem a órtese.
Aproximadamente, 10% das crianças diagnosticadas com escoliose idiopática têm progressão da curva exigindo cirurgia corretiva 10. Atualmente, não existe um método comprovado ou teste disponível para identificar este grupo de doentes. Consequentemente, todas as crianças diagnosticadas são submetidos a várias radiografias ao longo de vários anos, geralmente até atingirem a maturidade esquelética. Estima-se que os doentes com escoliose típicos terãoaproximadamente 22 exames radiológicos durante um período de 3 anos 11. Devido ao risco potencial de vários exames radiográficos, as abordagens alternativas que poderiam permitir a realização do prognóstico de escoliose idiopática, sem expor as crianças à radiação ionizante são fortemente desejável. Com o intuito de atender a essa necessidade, que já desenvolveu um ensaio de triagem baseada em células como teste preditivo para identificar mais cedo as crianças assintomáticas em risco de desenvolver escoliose idiopática. O teste prevê o resultado clínico em crianças assintomáticas e afectadas pelo examinando o estado funcional de proteínas Gi e classificar as crianças em três grupos funcionais (FG1, FG2 e GF3) de acordo com o grau de resposta à estimulação máxima proteína Gi 12 medido pelo CDS sistema baseado. Este sistema é largamente utilizado para avaliar a transdução de sinal através de proteínas G em vários tipos de células 13,14,15,16. Ela produz informação sobre oresposta total integrada das células aos estímulos externos, medindo mudanças na impedância após a ativação de receptores de superfície celular. As células são semeadas em microplacas que contêm eléctrodos no fundo dos poços e o sistema aplica uma pequena voltagem que induzem correntes extracelular e intracelular. Após a injecção composto para dentro do poço, os receptores da superfície celular são estimulados e os eventos de transdução de sinal de ocorrer, conduzindo a alterações celulares que afectam o fluxo de correntes extracelulares e transcelular, e, assim, afectar a grandeza medida. Com esta abordagem, os pacientes com escoliose e crianças em maior risco de desenvolver escoliose são menos sensíveis às Gi estimulação proteína quando comparados com indivíduos saudáveis, ea classificação é baseada na porcentagem de grau de redução em relação ao grupo controle. Os intervalos de classificação são fixos entre 10 e 40% para FG3, 40 e 60% para FG2, e 60 e 90% para FG1 12.
<p class = "jove_content"> Mais recentemente, tem modificações nesta abordagem, demonstrando que os três grupos funcionais podem ser claramente distinguidos de acordo com o perfil de desequilíbrio entre a resposta à estimulação Gi e Gs. Na verdade, descobrimos que a resposta à estimulação Gi predominou no FG3, enquanto nenhum desequilíbrio aparente foi observada em FG2. Em contraste, FG1 exibiu predominância da resposta à estimulação Gs. Além disso, nós fornecemos a evidência de que os pacientes pertencentes a FG2 correm mais risco de progressão para o ponto de precisar de cirurgia 17. A precisão do teste de classificação tem sido melhorada através da demonstração de um efeito diferencial da osteopontina (OPN) em resposta à estimulação Gi entre grupos funcionais.Aqui nós documentar os passos detalhados de procedimentos experimentais e analíticos deste teste funcional como atualmente realizados em nosso laboratório.
Nós descrevemos um procedimento detalhado de um teste baseado em células prognóstico para escoliose idiopática que é aplicável a células mononucleares do sangue periférico (PBMC) recém isolado ou conservado congelado por até um ano em nitrogênio líquido. Desde a utilização de PBMC recém-isoladas é complicado quando se testa grande número de indivíduos, o procedimento foi presenteado com PBMC congelados, que oferecem uma alternativa mais prática em ambiente clínico. No entanto, problemas com a acumulação de células durante o descongelamento foram encontrados quando PBMC congelados foram inicialmente utilizados, conduzindo, por vezes, a variabilidade inter-ensaio. Para maximizar ensaio reprodutibilidade, recomendamos evitar ciclo de congelamento-descongelamento e usando a amostra congelada apenas uma vez. O processo é muito simples, o que permite a detecção precisa da função da proteína Gi defeito num curto espaço de tempo. Usando este procedimento, crianças assintomáticas e com escoliose pode ser facilmente classificada para melhor prever sua evolução clínica, sem qualquer perigo para a sua saúde. HoWever, ao realizar a classificação de acordo com o grau de resposta à estimulação máxima Gi em relação aos controles saudáveis 12, vários requisitos para os assuntos de controle devem ser cumpridos. De fato, a fim de ter uma coorte comparação adequada, os indivíduos do grupo controle deve ser a idade e sexo do, não estar em qualquer tipo de medicação, e fornecer informações privadas, como a história individual / familiar passado médica. Estes requisitos podem constituir um obstáculo importante para o recrutamento de indivíduos controle. Por conseguinte, a realização de classificação por análise do grau de desequilíbrio entre a resposta e Gi Gs estimulação proteína no mesmo indivíduo, é ideal para eliminar a necessidade da utilização de sujeitos de controlo.
A utilização do sistema à base de CDS para realizar este teste prognóstico é significativa em termos de proporcionar simultaneamente Gi-e respostas celulares mediadas Gs no mesmo ensaio. Embora muitos pacientes podem ser classificados sem amambigüidade utilizando a gama dinâmica fixa para este ensaio, um pequeno número de pacientes que apresentam valores no limite de intervalos, tal como ilustrado pelos resultados do presente relatório. Para discriminar estes indivíduos, que foram introduzidas a avaliação do efeito de OPN em resposta à estimulação Gi, demonstrando que a OPN induz um efeito diferencial em resposta celular mediada por Gi entre os três grupos funcionais. Com efeito, verificou-se que em presença de OPN, resposta a estimulação Gi aumenta em que FG1, ao mesmo tempo que diminui em FG2 e FG3, a uma maior extensão no FG2. Apesar do elevado custo de OPN, o uso desta quimioquina é essencial para distinguir os casos ambíguos, e, por conseguinte, aumentar a precisão do nosso ensaio de classificação. Contudo, este ensaio tem uma desvantagem na medida em que um mínimo de 1,5 x 10 5 células por poço, é necessário observar a resposta celular com o sistema com base em CDS sob as nossas condições experimentais. Certas amostras dos doentes não têm um número suficiente deAs células a serem testadas. Neste caso, é necessário recordar os pacientes para coleta de sangue adicional, que pode ser preocupante para as famílias e frustrante para a equipe médica e laboratorial. Estudos prospectivos são planejadas em nosso laboratório para resolver esse problema.
No entanto, o protocolo actual baseia-se métodos simples e com provas dadas para preparar as células, enquanto o ensaio é automatizado usando um sistema de livre-etiqueta validado 13, 14, para monitorizar as respostas das células. A plataforma de ensaio é relativamente barata quando comparada com a plataforma genética disponível para o prognóstico de outras doenças. Além disso, o custo de todos os materiais descartáveis, incluindo os tubos de coleta de sangue, dicas, o eletrodo especial microplacas, e cônico e tubos de Eppendorf, e não é muito caro e é estimada em menos de US $ 3.000 para completar um teste para cerca de mil pacientes. Embora esta estimativa não inclui os custos de trabalho para a preparação de amostrase realização do teste, este teste permanece consideravelmente mais acessível do que as plataformas de sequenciamento de próxima geração. Notável, não é apenas a comparação de custos de plataformas genéticas, mas mais especificamente relacionadas ao campo da AIS, são os custos associados ao exame radiológico. Hoje, mais de um milhão de crianças nos EUA e cerca de 100.000 crianças no Canadá são diagnosticados com escoliose idiopática, eo custo total de diagnóstico e acompanhamento das crianças com escoliose através da exposição de raios-X é mais de 2,5 bilhões de dólares por ano na América do Norte. Assim, o nosso procedimento de ensaio de base celular que seria esperado para ser adequado para o rastreio e monitorização de crianças com escoliose idiopática, sem risco para a saúde e a custos mais baixos de rotina.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por doações do La Fondation Yves Cotrel de l'Institut de France, Paris, França (ao Dr. Moreau), The Canadian Institutes of Health Research (PP2 conceder-99466 com o Dr. Moreau) e da Quarta Dimensão Spine LLC , New York, EUA (bolsa de pesquisa do Dr. Moreau).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |