구조화 된 프로토콜은 셀룰러 유전체 분광법 (CDS)를 사용 특발성 측만증의 예후를 예측하는 기능 테스트와 같은 세포 기반 분석을 위해 제시된다. 분석은 신선하거나 냉동 된 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)로 수행 될 수 있고 절차는 4 일 안에 완료된다.
이 프로토콜은 증상과 영향을받는 어린이 특발성 척추 측만증의 예후를 예측할 수있는 기능 테스트로 우리의 실험실에서 개발 된 세포 기반 분석을위한 실험 및 분석 절차에 대해 자세히 설명합니다. 분석은 삼 관능기 (FG1에 자동 CDS 기반 기기, 어린이의 분류를 사용하여, 세포의 유전 분광법 (CDS)에 의해 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 GI와 Gs의 단백질의 기능 상태의 평가 이루어져 GI와 천불 단백질의 자극에 대한 반응의 정도 사이의 불균형의 프로파일에 대하여, FG2, FG3). 분류는 더 그룹과 질병의 심각한 진행을 FG2에 의해 참조되는 가운데 위장관 자극에 대한 응답에 오스테 오 폰틴 (OPN)의 차동 효과에 의해 확인된다. 약, 혈액 10 ㎖의 볼륨이 피콜 – 그라데이션과 세포에 의해 PBMC를 추출하는 데 필요한 그 후 액체 질소에 저장됩니다. P의 적절한 수의골수 세포 분석을 수행 할 수는 세포 배양 두 일 후에 얻을 수있다. 기본적으로, 세포는 처음 phytohemmaglutinin (PHA)와 함께 배양된다. 24 시간 배양 후, 매체는 이전의 세포 파종 및 OPN의 치료에 추가로 24 시간 동안 PHA없는 배지로 대체됩니다. 세포는 다음 광학적으로 각각 자신의 동족 수용체를 통해 GI와 Gs의 단백질을 활성화 소마토스타틴 (somatostatin)과 이소에 대한 답변, 상영된다. 소마토스타틴 및 이소 프로 테레 놀은 모두 동시에 집적 유체 시스템으로 주입되고 세포의 반응은 15 분 동안 모니터링된다. 분석은 신선하거나 동결 된 PBMC를 사용하여 수행 될 수 있고 절차는 4 일 안에 완료된다.
특발성 척추 측만증은 일반적으로 척추 회전 1과 함께 10도보다 큰 측면 곡률로 정의 원인을 알 수없는 척추 기형이다. 조건은 소아 인구의 4 %에 영향을 미치는 가장 일반적으로 9~13년 2,3,4 세 사이에 진단됩니다. 진단은 주로 배제되며 해당 척추 기형, 신경 근육 또는 syndromic 질환으로 척추 기형의 다른 원인을 배제 이후됩니다. 전통적으로, trunkal 비대칭 아담스 앞으로 굽힘 시험에 의해 밝혀 및 신체 검사 5시 된 scoliometer으로 측정된다. 진단은 방사선 투과 곡선의 관찰 및 콥 방법 6을 사용 각도 측정에 의해 확인 될 수있다.
일단 진단, 측만 아이들을 관리하는 의사에 대한 주요 관심사는 커브가 진행할지 여부입니다. 사실, 곡선의 진행은 종종 예측 불가능하고더 자주 여자 사이에서 관찰 소년 7보다. 치료되지 않는 경우, 곡선은 중요한 신체 기형, 심지어 심장과 폐에 문제를 만드는 극적으로 진행하실 수 있습니다. 이러한 증상은 곡선이 70 ° 8,9를 초과 할 경우 생명을 위협이된다. 곡선의 진행을 방지하거나 중단하는 현재의 치료 옵션이 보강 수술이 (가) 있습니다. 수술 곡선보다 45 ° 또는 보강에 응답하기 위해 예약되어있는 동안 일반적으로, 보강은 25 ~ 40 ° 사이의 곡선을 권장합니다.
약, 특발성 척추 측만증으로 진단 된 아이들의 10 %는 교정 수술 (10)을 필요로하는 곡선의 진행을해야합니다. 현재, 더 입증 된 방법이나 환자의이 종류를 식별 할 수 시험은 없습니다. 결과적으로, 모든 진단 어린이들은 골격 성숙에 도달 보통 때까지 몇 년 동안 여러 방사선 촬영을 실시한다. 그것은 척추 측만증을 가진 전형적인 환자가있을 것으로 추정된다3 년 동안 11에 약 22 방사선 검사. 때문에 여러 방사선 학적 검사의 잠재적 인 위험, 전리 방사선에 아이들을 노출하지 않고 특발성 척추 측만증의 예후를 수행 할 수있는 다른 방식의 접근이 강하게 바람직하다. 이러한 요구를 충족 할 목적으로, 우리는 이전에 빨리 특발성 척추 측만증을 개발의 위험에 자각 증상이없는 아이들을 식별 할 수있는 예후 시험으로 세포 기반 스크리닝 검사를 개발했습니다. 시험은 GI 단백질의 기능적 상태를 검사하고 CDS 의해 측정 GI 단백질 자극 (12)의 최대 반응의 정도에 따라 삼 관능기 (FG1, FG2 및 FG3)에 어린이를 구분하여 두 무증상 및 영향 어린이의 임상 결과를 예측 기반 시스템. 이 시스템은 주로 다양한 세포 유형 13,14,15,16에서 G 단백질을 통해 신호 전달을 평가하기 위해 사용된다. 그것은에 관한 정보를 얻을세포 표면 수용체의 활성화 아래의 임피던스의 변화를 측정함으로써, 외부 자극에 대한 세포의 전체 통합 반응. 세포를 웰의 바닥에 전극을 포함하고, 시스템은 세포와 세포 횡단 전류를 유도 작은 전압을인가 즉 마이크로 플레이트로 시딩 하였다. 잘로 화합물 주입 후, 세포 표면 수용체가 자극 및 신호 전달 사건은 세포와 세포 횡단 전류의 흐름에 영향을 미치는 세포 변화 선도 발생시켜 측정 크기에 영향을 미친다. 이 방법을 사용, 척추 측만증을 개발의 위험에 측만 환자와 아이들 더 건강한 대조군과 비교했을 때 GI 단백질의 자극에 덜 반응하고, 분류는 그룹을 제어 할 수 감소의 상대적인 정도의 비율에 따라 결정됩니다. 분류 범위는 FG3, 40 FG2에 대한 60 %, 60 및 FG1 12 90 % 10 40 % 사이에 고정되어 있습니다.
<p class = "jove_content"> 최근 우리 삼 관능기 깨끗이 GI와 Gs의 자극에 응답 간의 불균형의 프로파일에 따라 구별 될 수 있다는 것을 입증함으로써이 방법을 수정 한. 사실, 우리는 명백한 불균형이 FG2에서 관찰하는 동안 위장관 자극에 반응, FG3에서 우세한 것으로 나타났습니다. 대조적으로, FG1 지에스 자극에 응답 우위를 보였다. 또한, 우리는 FG2에 속하는 환자는 수술 17를 필요로하는 시점에 진행 위험이 더 있다는 증거를 제공했다. 이 분류 시험의 정밀도는 더 작용기 사이 위장관 자극에 응답에 오스테 오 폰틴 (OPN)의 차동 효과를 입증함으로써 개선되었습니다.여기에서 우리는 현재 우리의 실험실에서 수행이 기능 테스트의 실험 및 분석 방법의 세부 단계를 문서화합니다.
우리는 갓 격리 또는 액체 질소에서 최대 1 년 동안 냉동 보존 말초 혈액 단핵 세포에 적용 할 수있다 특발성 척추 측만증에 대한 세포 기반 예후 테스트 (PBMC를)에 대한 자세한 절차를 설명했다. 개인의 큰 숫자를 테스트 할 때 갓 고립 된 PBMC를 사용하는 것이 부담이되기 때문에, 절차는 임상 환경에서보다 실용적인 대안을 제공 냉동 PBMC를 제시했다. 냉동 된 PBMC를 처음 분석 간 변동에 때때로 선도, 사용 된 경우에는, 해동시 세포 응집에 문제가 발생했다. 분석의 재현성을 극대화하기 위해, 우리는 동결 – 해동 사이클을 피하고 한 번 고정 된 샘플을 사용하는 것이 좋습니다. 절차는 단시간에 결함 GI 단백질 기능의 정확한 검출을 허용 매우 간단하다. 이 절차를 사용하여, 증상 및 측만 아이들은 쉽게 더 나은 자신의 건강에 대한 위험없이 임상 결과를 예측하는 분류 될 수있다. 호건강한 대조군 12 GI 자극 상대에 대한 최대 응답의 정도에 따라 분류를 수행 할 때 Wever에게는 대조군에 대한 몇 가지 요구 사항이 충족되어야한다. 실제로, 적절한 비교 코호트를 갖기 위해, 대조군은 약물의 종류에 있어야하고, 그러한 과거 개별 / 가족 병력 등의 개인 정보를 제공하지, 나이 및 성별과 일치해야한다. 이러한 요구 사항은 대조군의 채용에 중요한 장애물을 구성 할 수있다. 따라서, 동일한 개인의 GI와 Gs의 단백질 자극에 응답 사이의 불균형의 정도를 검사함으로써 종별을 수행하면 대조군을 사용의 필요성을 제거하기 위해 이상적이다.
이 예후 테스트를 수행하는 CDS-기반 시스템의 이용은 동시에 동일한 분석에서 GI와 GS-매개 세포 반응을 제공하는 측면에서 중요하다. 많은 환자 명 AM으로 분류 될 수 있지만본 보고서의 결과에 의해 도시 된 바와 같이 biguity이 분석을 위해 고정 된 동적 범위를 이용하여, 환자의 소수는, 광범위의 경계에서의 값을 나타낼 것이다. 이러한 개인을 구별하기 위해, 우리는 OPN은 세 가지 기능 그룹 중 GI-매개 세포 반응에 차등 효과를 유도하는 것을 보여줌으로써 위장관 자극에 응답에 OPN의 효과의 평가를 소개했다. 사실, 우리는 OPN, FG1에있는 위장관 자극의 증가에 대응하여,의 존재가 FG2에서 더 높은 정도, FG2와 FG3 감소하는 동안 것으로 나타났습니다. OPN의 높은 비용에도 불구하고, 본 케모카인의 사용이 모호한 경우를 구별하고, 따라서 우리 종별 분석의 정확성을 향상시키기 위해 필수적이다. 그러나 이러한 분석은 웰 당 1.5 × 105 세포의 최소값은 우리 실험 조건 하에서 CDS 기반 시스템과 세포 반응을 관찰하기 위하여 필요하다는 단점이있다. 특정 환자의 샘플은 충분한 수의가되지 않습니다시험되어야하는 세포. 이 경우에는 의료 검사실 직원 가정용 우려 초조 수있는 추가 채혈을 위해 환자를 호출 할 필요가있다. 전향 적 연구는이 문제를 해결하기 위해 우리 실험실에서 계획되어 있습니다.
그럼에도 불구하고, 현재의 프로토콜 테스트가 세포의 반응을 모니터링하기 위해 검증 된 레이블이없는 시스템 (13, 14)를 사용하여 자동화하는 동안 세포를 준비하는 간단하고 입증 된 방법을 사용합니다. 다른 질병의 예후에 해당하는 유전 플랫폼과 비교하여 테스트 플랫폼은 상대적으로 저렴하다. 또한, 혈액 수집 튜브, 조언, 특수한 전극 마이크로 플레이트, 및 원추형하고 에펜 도르프 튜브를 포함하여 모든 일회용 재료의 비용은 매우 고가가 아니며 약 천 환자에 대한 테스트를 완료 할 $ 3,000 이하로 추정된다. 이 추정치는 샘플의 제조를위한 인건비를 포함하지 않지만및 테스트를 수행,이 테스트는 상당히 저렴한 차세대 시퀀싱 플랫폼보다 남아있다. 주목할는 유전 플랫폼 비용 비교뿐만 아니라, 그러나보다 구체적 AIS의 분야에 관련, 방사선 촬상에 관련된 비용이다. 오늘날, 미국에서 백만 명 이상의 아이들과 캐나다에서 약 100,000 아이들은 특발성 척추 측만증으로 진단하고, X-선 노출에 의한 진단과 측만 아이들의 감시의 총 비용은 북미에서 연간 25 억 달러 이상입니다됩니다. 따라서, 우리의 세포 기반 분석의 절차는 일상적인 검사 및 건강 위험없이 저렴한 비용으로 특발성 척추 측만증 아동의 모니터링에 적합 할 것으로 예상된다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 (닥터 모로에) 라 매그 이브 Cotrel 드 난 문화원 드 프랑스, 파리, 프랑스에서 교부금에 의해 지원되었다, 건강 연구의 캐나다 연구소는 (닥터 모로에 PP2-99466을 부여)와 네 번째 차원 척추 LLC에서 , 뉴욕, 미국 (닥터 모로에 연구 보조금).
Materials | |||
RPMI | Wisent, Inc | 350-005-CL | |
FBS | Therno Scientific Hyclone | SH3007103 | |
DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
Ficoll-Plaque Plus | GE Healthcare | 17144003 | |
Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
Phytohemagglutinin | Invitrogen (Gibco) | 10576-015 | |
Recombinant Human Osteopontin | R&D Systems, Inc | 1433-OP/CF | |
Somatostatin | Tocris | 1157 | |
Isoproterenol | Tocris | 1743 | |
PBS | Wisent, Inc | 311-010-CL | |
Sterile pipette tips | Axygen Scientific | 301-06-451 | |
Sterile Eppendorf tubes | Ultident | 24-MCT-150-C | |
50 ml conical tubes | VWR International | 89039-658 | |
Cellkey small sample 96W microplate | Molecular Devices | 1026496 | |
Cellkey tips | Cybio | OL3800-25-559N | |
Precut pierceable seals | Excel Scientific, Inc | XP-100 | |
Equipment | |||
Vicell XR | Beckman Coulter | 731050 | Automated cell counter |
Cell culture hood | Forma Scientific | 1284 | Class II |
Liquid nitrogen storage | Thermo Scientific | CY5093570 | |
Water bath | VWR International | 89032-204 | |
Standard light microscope | Leica Microsystems | DMIL LED | |
Cell culture incubator | Thermo Scientific | 51019557 | 5% CO2 at 37 °C |
Low speed centrifuge | Thermo Scientific | 75004364 | |
Cellkey system | Molecular Devices | 1019185 | CDS-based instrument |